張順利，顧運濤，陳 榮，趙 海

(海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院骨科一區(qū)，海南 ?？?570102)

椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration，IDD)是一種常見的脊柱復雜疾病，會導致患者脊柱功能障礙和生活質(zhì)量降低[1]。IDD常引起下腰痛，這是中老年群體中常見的癥狀，可造成巨大的社會負擔[2]。正常的髓核可維持椎間盤的結(jié)構(gòu)和功能，髓核衰老和功能受損是IDD發(fā)生的潛在原因[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在IDD過程中存在細胞外基質(zhì)丟失、正常椎間盤髓核細胞表型改變、促炎細胞因子釋放等現(xiàn)象，而干預髓核細胞的改變可以延緩椎間盤退變的進程[4-5]。有研究表明，多種炎性細胞因子的表達增加都與IDD的發(fā)生有關，白細胞介素(interleukin-1β，IL-1β)與腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-alpha,TNF-α)在IDD患者的髓核和纖維環(huán)細胞中表達均增加[6]。IL-1β與TNF-α可通過增加其他細胞因子的水平，誘導ADAMTS-4、ADAMTS-5和MMPs的表達，并抑制細胞外基質(zhì)的合成[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，山竹醇具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護、抗菌等[10-14]。飼糧中添加山竹醇可通過改善仔豬的抗氧化能力，改變應激導致的脂質(zhì)代謝紊亂，從而保護肝[13-14]。同時，山竹醇可通過抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥，發(fā)揮治療骨關節(jié)炎的作用[10]。然而，山竹醇對椎間盤退行性變的治療作用尚不明確。因此，本研究通過探討山竹醇對IL-1β刺激的髓核細胞的保護作用，及對其炎癥反應和相應基質(zhì)代謝水平的作用，以期為臨床治療IDD提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

SD大鼠(2個月齡)購自中國科學院動物中心(上海)，山竹醇購自Sigma Aldrich公司，重組大鼠IL-1β購自Pepro Tech公司，一抗p-p65、p65、抗IκBα和抗β-actin抗體購自Abcam公司。所有動物實驗均經(jīng)海南醫(yī)學院倫理委員會批準。

1.2 大鼠髓核細胞培養(yǎng)及處理

大鼠髓核細胞分離和培養(yǎng)的步驟參考文獻[15]。SD大鼠用過量戊巴比妥鈉安樂死，在無菌條件下收集L1～L5段腰椎間盤。解剖顯微鏡下從腰椎間盤中分離髓核組織，用0.25%胰蛋白酶及0.1% Ⅱ型膠原酶于37 ℃處理4 h，然后用含有1%青鏈霉素的DMEM/F12進行培養(yǎng)，每隔1 d更換1次完整的培養(yǎng)基。使用傳代至第二代的髓核細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 MTT法檢測髓核細胞活力

將大鼠髓核細胞接種于96孔板中，每孔8 000個。培養(yǎng)24 h后，根據(jù)細胞貼壁時間的不同，用含不同濃度(0、1、2.5、5、10 μM)山竹醇(溶于DMSO)聯(lián)合或不聯(lián)合IL-1β的新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。向每個孔中加入10 μL MTT溶液，細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，使用酶標儀在OD 570 nm處測量每孔的吸光度值。

1.4 Western blot檢測相關蛋白表達

用含不同濃度山竹醇(0、2.5、5 μM)聯(lián)合或不聯(lián)合IL-1β的新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，分為Control組、IL-1β組、IL-1β+Gar 2.5 μM組和IL-1β+Gar 5 μM組，其中Control組用0 μM山竹醇不聯(lián)合IL-1β處理髓核細胞，IL-1β組用0 μM山竹醇聯(lián)合IL-1β處理髓核細胞，IL-1β+Gar 2.5 μM組用2.5 μM山竹醇聯(lián)合IL-1β處理髓核細胞，IL-1β+Gar 5 μM組用5 μM山竹醇聯(lián)合IL-1β處理髓核細胞，并用細胞裂解緩沖液收集。在冰上用細胞裂解液孵育30 min后，以12 000 r/min離心20 min，收集上清液，測量蛋白質(zhì)濃度，配制蛋白上樣標準品。蛋白質(zhì)(40 μg)在10%～12% SDS-PAGE凝膠上分離，轉(zhuǎn)載至PVDF膜上。將PVDF膜用封閉緩沖液孵育1 h，用p65(1∶1 000)、p-p65(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)的一抗溶液孵育過夜，然后與相應的二抗孵育1 h。通過ECL-Western印跡試劑盒檢測條帶，并利用ChemiDicTM XRS成像系統(tǒng)對目標條帶進行曝光，同時利用Image J圖像分析軟件進行統(tǒng)計。

1.5 定量RT-PCR檢測靶基因mRNA表達

為了研究山竹醇是否能調(diào)節(jié)IL-1β刺激下的髓核細胞分解代謝水平，本研究檢測了MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA水平的表達。為了進一步研究山竹醇對髓核細胞基質(zhì)代謝水平的影響，本研究檢測了山竹醇對IL-1β刺激下的髓核細胞中細胞外基質(zhì)蛋白(Col Ⅱ和Aggrecan)mRNA的表達水平的影響。用TRIzol法提取各組髓核細胞總RNA，用1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用Prime-Script RT-PCR試劑盒和SYBR premix Ex Taq(Roche Diagnostics GmbH，Penzberg，Germany)預混料進行cDNA的合成和擴增。用DDCt法計算各靶基因mRNA水平，并將其標準化為內(nèi)參基因(β-actin)的相對水平。具體引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 免疫熒光染色檢測觀察p65核轉(zhuǎn)移

P65染色時將髓核細胞接種于6孔板載玻片上24 h，每孔1×105/mL。用含不同濃度山竹醇(0、5 μM)聯(lián)合或不聯(lián)合IL-1β的新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，分為Control組(0 μM山竹醇不聯(lián)合IL-1β)、IL-1β組(0 μM山竹醇聯(lián)合IL-1β)、以及IL-1β+Gar 5 μM組(5 μM山竹醇聯(lián)合IL-1β)。細胞處理后用4%多聚甲醛固定細胞15 min，用0.1% Triton X-100孵育5 min，用10%牛血清白蛋白于37 ℃封閉1 h后，用抗p65(1∶500)的一抗孵育過夜，然后用相應的二抗孵育1 h。用DAPI染色7 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 山竹醇抑制髓核細胞凋亡

MTT法檢測結(jié)果顯示，山竹醇在0～10 μM劑量下對大鼠髓核細胞無細胞毒性；IL-1β可誘導髓核細胞活力降低(P<0.05)，劑量為2.5～10 μM的山竹醇能夠改善IL-1β刺激下的髓核細胞活力(P<0.05)，見圖1。因此，取山竹醇2.5、5 μM劑量用于實驗。

a：一定濃度梯度的山竹醇對大鼠髓核細胞活力的影響；b：山竹醇對IL-1β刺激下髓核細胞活力的影響 *：與僅IL-1β刺激比較，P<0.05

2.2 山竹醇抑制IL-1β刺激的髓核細胞分解代謝活性

IL-1β刺激后髓核細胞中MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA表達水平顯著提高(P<0.05)，而山竹醇能抑制IL-1β刺激后的髓核細胞中MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA表達水平(P<0.05)，見圖2。

2.3 山竹醇改善IL-1β刺激后的細胞外基質(zhì)水平

IL-1β下調(diào)了髓核細胞中Col Ⅱ和Aggrecan mRNA表達水平(P<0.05)，而山竹醇則顯著改善了IL-1β刺激下髓核細胞中Col Ⅱ和Aggrecan mRNA表達水平(P<0.05)，見圖3。

2.4 山竹醇抑制IL-1β刺激的髓核細胞中炎癥因子水平增高

定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，IL-1β可顯著提高髓核細胞中TNF-α、IL-6、IL-8、COX-2和iNOS mRNA表達水平(P<0.05)；而山竹醇可抑制IL-1β誘導的TNF-α、IL-6、IL-8、COX-2和iNOS mRNA表達水平(P<0.05)，見圖4。

*：與IL-1β組比較，P<0.05

*：與IL-1β組比較，P<0.05

2.5 山竹醇抑制IL-1β刺激的髓核細胞中NF-κB信號通路

Western blot結(jié)果顯示，IL-1β激活了髓核細胞中的NF-κB信號通路，而山竹醇逆轉(zhuǎn)了IL-1β對NF-κB p65的活化作用(P<0.05)，同時逆轉(zhuǎn)了IL-1β引起的IκBα蛋白水平降低(P<0.05)，見圖5。免疫熒光染色結(jié)果顯示，IL-1β刺激下髓核細胞核中發(fā)生p65核轉(zhuǎn)移，山竹醇顯著抑制了p65向核的轉(zhuǎn)移(圖6)。

*：與IL-1β組比較，P<0.05

*：與IL-1β組比較，P<0.05

圖6 免疫熒光觀察p65核轉(zhuǎn)移(綠色：p65；藍色：細胞核)

3 討論

IDD發(fā)生在自然衰老過程中，是中老年人下腰痛最常見的原因，會造成巨大的社會經(jīng)濟負擔[3]。已有研究表明炎癥及細胞外基質(zhì)降解與IDD的病理過程有關[5，16]。基質(zhì)蛋白的丟失伴隨著基質(zhì)分解酶的上調(diào)，從而減弱了細胞外基質(zhì)的吸水性，導致髓核水分含量減少和椎間盤壓力下降[17]。MMPs(MMP-1、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5)在IDD過程中的蛋白水解酶作用是導致主要細胞外基質(zhì)蛋白Col Ⅱ和Aggrecan降解的主要因素。MMP-3、MMP-9和MMP-13是IDD過程中導致Col Ⅱ降解的關鍵酶，而ADAMTS-4和ADAMTS-5是導致Aggrecan降解的關鍵酶[18-20]。在IDD過程中，IL-1β和其他促炎因子上調(diào)，促炎因子的表達觸發(fā)了蛋白水解酶的產(chǎn)生，從而破壞了椎間盤內(nèi)細胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[21]。有研究表明，IL-1β可上調(diào)椎間盤中MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5等分解代謝酶的表達[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β通過增加MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達來增強蛋白水解作用，而山竹醇則可使上述指標的表達下降；同時，山竹醇可上調(diào)IL-1β刺激后的髓核細胞主要細胞外基質(zhì)蛋白(Col Ⅱ和Aggrecan)的基因表達。以上均表明，山竹醇可能在IL-1β刺激的髓核細胞中具有抗分解代謝作用，可保護基質(zhì)蛋白免受降解。

有研究表明炎癥與IDD的進展有關[23]。多種炎性細胞因子的表達增加與IDD變性的發(fā)生有關。在IDD過程中，促炎癥因子IL-1β、TNF-α和IL-6刺激髓核細胞產(chǎn)生更多的炎癥因子，導致細胞外基質(zhì)降解酶升高，細胞外基質(zhì)降解。促炎癥因子，尤其是TNF-α和IL-1β，在IDD中起重要作用[24]。有研究表明，IL-1β能夠上調(diào)細胞外基質(zhì)降解酶，包括MMPs、ADAMTS，導致Ⅱ型膠原和蛋白多糖降解，最后髓核由于失去細胞外基質(zhì)而嚴重降低保水能力，造成椎間盤內(nèi)壓力下降，功能受損[25]。在一項對豬的研究中發(fā)現(xiàn)，椎間盤內(nèi)注射TNF-α可導致IDD[26]。而相關研究發(fā)現(xiàn)，山竹醇具有廣泛的生物活性，包括抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護、抗菌[10-14]。飼糧添加山竹醇可通過提高仔豬的抗氧化能力，改善應激導致的脂質(zhì)代謝情況，從而保護肝[13-14]。山竹醇可通過抑制小膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥因子的表達，治療相關的神經(jīng)病理性疼痛[11]。同時，山竹醇可通過抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥，治療骨關節(jié)炎[10]。本研究結(jié)果顯示，山竹醇可降低iNOS、COX-2、IL-6、IL-8和TNF-α表達水平，這提示山竹醇可抑制IDD過程中的炎癥反應。

NF-κB是IDD進展過程中的關鍵分子。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可誘導NF-κB磷酸化[27-28]。NF-κB信號通路是IDD過程中一個重要的信號通路，具有誘導基質(zhì)降解、促進炎癥和抑制細胞外基質(zhì)合成的能力[29]。NF-κB通常位于細胞質(zhì)中，并與IκBα結(jié)合，IL-1β的刺激可釋放NF-κB，并促進NF-κB從細胞質(zhì)向細胞核轉(zhuǎn)移，隨后促進炎癥因子(如MMPs、iNOS、COX2和IL-6等)的表達[30-31]。山竹醇可通過抑制NF-κB信號通路，從而抑制IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥和骨關節(jié)炎[20]。本研究結(jié)果顯示，山竹醇可通過抑制IκBα的降解，顯著抑制IL-1β誘導的NF-κB激活，從而增加核內(nèi)NF-κB的表達。這些結(jié)果表明，山竹醇能通過抑制NF-κB核移位和IkBα降解從而抑制IL-1β誘導的髓核細胞NF-κB活化。

綜上，山竹醇可抑制IL-1β刺激下的髓核細胞炎癥和細胞外基質(zhì)降解，同時山竹醇可通過抑制NF-κB信號通路達到保護作用。因此，山竹醇對預防IDD有一定的作用，有望成為一種新的IDD治療藥物。