譚 芳， 胡 娟， 李 擎， 楊曉燕， 雷小勇

(南華大學(xué)湖南省分子靶標(biāo)新藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心 南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南省衡陽市421001)

RASAL2蛋白是由RASAL2基因編碼的一種RAS-GTP酶活性蛋白(RAS GTPase activating protein， RASGAP)[1]。RASGAP主要負(fù)責(zé)促進(jìn)RAS基因RASGTP酶的活性，既往研究發(fā)現(xiàn)人類20%～30%的腫瘤發(fā)生是由于RAS突變而導(dǎo)致的三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate, GTP)水解發(fā)生障礙[2-4]。 而RASAL2作為RAS基因的一個重要的活性蛋白，主要作為一個抑癌因子參與腫瘤進(jìn)展。然而，調(diào)控RASAL2表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚。

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)作為一類單鏈非編碼RNA，長度約為22個核苷酸，具有高度保守性。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA主要通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)堿基互補(bǔ)配對，來阻礙靶基因mRNA翻譯成蛋白質(zhì)或?qū)е缕浣到?，這屬于在轉(zhuǎn)錄后水平的一種調(diào)控基因表達(dá)的方式[5-8]。大量研究表明，miRNA 在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、耐藥等各種生理病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-11]。本課題組通過在線數(shù)據(jù)庫Targetscan發(fā)現(xiàn)，RASAL2 3′-UTR可能存在與miR-1290互補(bǔ)配對的結(jié)合序列。miR-1290在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，miR-1290能夠與hMSH2、FOXA1、NFIX等多種基因3′-UTR區(qū)結(jié)合進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[12-14]。然而，miR-1290與RASAL2之間是否存在靶向調(diào)控機(jī)制還不清楚。因此，本研究以miR-1290為研究對象，采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)來證實(shí)其與RASAL2基因的靶向關(guān)系，希望能為miR-1290在腫瘤中調(diào)控機(jī)制的研究工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人腎上皮細(xì)胞293T購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫；引物合成委托上海捷瑞生物工程有限公司完成；TOP10感受態(tài)細(xì)胞、GV272載體及miR-1290質(zhì)粒均購于上海吉凱基因。主要試劑：高糖培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)(Corning cellgro)、胎牛血清和Opti-MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent購自Roche公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶XbaI/XbaI均為New England Biolabs公司產(chǎn)品；熒光定量PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技有限公司；雙熒光報告檢測系統(tǒng)購自Promega公司。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(cat.No: MCO-175，SANYO)；熒光顯微鏡(cat.No: IX71，奧林帕斯)；離心機(jī)(cat.No: Fresco 21，賽默飛世爾科技有限公司)；酶標(biāo)儀(cat.No: M2009PR，Tecan infinite)；倒置顯微鏡(cat.No: XDS-100，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)。

1.3 生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-1290的靶基因

利用Targetscan數(shù)據(jù)庫搜索與miR-1290種子區(qū)匹配的保守位點(diǎn)，預(yù)測miR-1290的潛在靶基因。

1.4 野生型與突變型RASAL2雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

利用NCBI數(shù)據(jù)庫獲取RASAL2基因3′-UTR堿基序列，交由上海捷瑞生物工程有限公司合成相應(yīng)的擴(kuò)增引物序列，RASAL2上游引物：5′-GAGGAGTTGTGTTTGTGGAC-3′，下游引物：5′-GACGATAGTCATGCCCCGCG-3′。提取293T細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)最終合成3′-UTR序列片段，利用XbaI/XbaI內(nèi)切酶在相應(yīng)識別點(diǎn)進(jìn)行酶切、純化后，與GV272載體連接。然后重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞，鑒定陽性克隆轉(zhuǎn)化子，并用含氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化回收。取適量菌液進(jìn)行測序鑒定。

1.5 雙熒光素酶活性檢測

將呈指數(shù)式生長的293T細(xì)胞消化并吹打成懸液，并接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為105個，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中至細(xì)胞融合度約60%～70%，參照X-tremegene HP轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作：①將X-tremegene HP轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒按每孔1 μg∶2 μL的比例移至100 μL opti-MEM中，充分混勻，靜置20 min；②棄掉培養(yǎng)板中舊培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染試劑X-tremegene HP混合液與質(zhì)粒移至細(xì)胞培養(yǎng)板，孵育5～6 h后，每孔補(bǔ)加培養(yǎng)基(含10% FBS)200 μL。③48 h后，棄全部培養(yǎng)液，并加入1× Passive Lysis Buffer 300 μL，4 ℃條件放置20 min，使293T細(xì)胞裂解完全，輕輕地震蕩3～5 min，混勻后，吸取40 μL細(xì)胞裂解液，加入20 μL Luciferase Assay Reagent，于檢測板中再次震蕩，上機(jī)檢測熒光素酶活性；④檢測完畢后，向每孔中加入20 μL Stop & Glo?Reagent，混勻后，靜置3 min，檢測海腎熒光酶活性，接著進(jìn)行結(jié)果定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-1290與RASAL2 3′-UTR互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測

通過在線數(shù)據(jù)庫Targetscan預(yù)測RASAL2是否為miR-1290可能的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-1290與RASAL2 3′-UTR存在堿基互補(bǔ)序列，是一個潛在結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。

圖1 miR-1290與RASAL2互補(bǔ)結(jié)合的靶位點(diǎn)

2.2 PCR擴(kuò)增與酶切產(chǎn)物鑒定

瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明，野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR及突變型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小一致，代表質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2)。經(jīng)XbaI/XbaI內(nèi)切酶酶切后，載體片段和不同長度的啟動子片段相對分子質(zhì)量均一致，說明質(zhì)粒被成功構(gòu)建(圖3)。

圖2 RASAL2基因3′-UTR重組質(zhì)粒PCR瓊脂糖電泳結(jié)果M為DNA Marker;1為RASAL2-wt 3′-UTR PCR擴(kuò)增物；2為RASAL2-mut 3′-UTR PCR擴(kuò)增物。

圖3 熒光素酶報告基因質(zhì)粒瓊脂糖電泳結(jié)果1為空載體-陰性對照；2為GAPDH-陽性對照；M為Marker；3～5為RASAL2野生型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物；6～8為RASAL2突變型重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。

2.3 RASAL2基因野生型及突變型報告質(zhì)粒測序結(jié)果

通過比較圖4中的RASAL2基因3′-UTR野生型測序峰圖和圖5 RASAL2基因3′-UTR突變型部分測序峰圖可知，已成功將靶序列AAAATCC(6245～6252)突變?yōu)镃CCCGAA。說明兩種質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 雙熒光素酶活性驗(yàn)證

如圖6所示，與野生型質(zhì)粒(GV272-RASAL2-wt 3′-UTR)+miR-NC組相比，野生型質(zhì)粒(GV272-RASAL2-wt 3′-UTR)+miR-1290組的相對熒光素酶活性差異無顯著性(P=0.053)，說明miR-1290不能與RASAL2基因3′-UTR結(jié)合，進(jìn)而無法抑制其表達(dá)；而突變型質(zhì)粒(GV272-RASAL2-mut-3′-UTR)+miR-1290組的相對熒光素酶活性相較于突變型質(zhì)粒(GV272-RASAL2-mut 3′-UTR)+miR-NC組無顯著變化。以上說明miR-1290與miR-NC均無法抑制突變型質(zhì)粒熒光素酶活性。

圖4 RASAL2基因3′UTR野生型部分測序圖

圖5 RASAL2基因3′UTR突變型部分測序圖

圖6 miR-1290對RASAL2基因3′-UTR相對熒光素酶活性的影響

3 討 論

RASAL2蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中通常作為一種抑癌因子發(fā)揮作用。然而，調(diào)控RASAL2表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究借助在線預(yù)測數(shù)據(jù)庫尋找到一些對RASAL2基因具有靶向調(diào)控作用的miRNA。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，更多的miRNAs被發(fā)現(xiàn)，但對于它在疾病中的調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能仍值得深究[15]。一些研究證實(shí)，一個miRNA 可與多種mRNA結(jié)合，而不同miRNA也可能競爭同個mRNA結(jié)合位點(diǎn)。近年來， miRNA在腫瘤發(fā)展中的關(guān)鍵作用得到重視。miR-1290在急性淋巴細(xì)胞白血病、肺癌及胃癌等多種惡性腫瘤中均發(fā)揮抑制作用[13,16-17]。因此，成功預(yù)測并驗(yàn)證調(diào)控RASAL2基因表達(dá)水平的miRNAs，進(jìn)一步闡明其在胃癌中調(diào)控機(jī)制及對胃癌細(xì)胞的表型影響，這將有利于胃癌的臨床治療，并為發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物及分子靶點(diǎn)提供思路。

雙熒光素酶報告基因檢測和蛋白免疫印跡是目前較常用于miRNA靶基因驗(yàn)證的方法[18-19]。本研究采用生物信息學(xué)預(yù)測方法，結(jié)合熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，通過將目的基因RASAL2 3′-UTR序列插入GV272載體，利用miRNA陰性對照及靶基因RASAL2 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變，通過檢測熒光素酶活性來驗(yàn)證miR-1290與RASAL2 3′-UTR結(jié)合情況。結(jié)果表明：miR-1290對RASAL2基因 3′-UTR熒光素酶活性無明顯抑制，初步證實(shí)了RASAL2與miR-1290不存在靶向關(guān)系。因此，RASAL2的抑癌作用可能是通過其他調(diào)控機(jī)制或受miR-1290的間接調(diào)控，而并非靶向調(diào)控。

本研究成功構(gòu)建了RASAL2基因3′-UTR的雙熒光素酶報告載體，并確證了miR-1290與RASAL2基因不存在直接靶向關(guān)系。