曹曉麗， 蘇世文， 賈 英

(1.重慶市壁山區(qū)中醫(yī)院， 重慶市402760；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，重慶市 400042)

宮頸癌是臨床最常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率位居中國女性惡性腫瘤第2位，僅次于乳腺癌，30～35歲為原位癌的高發(fā)年齡，45～55歲為浸潤癌的高發(fā)年齡[1]。隨著人們生活和飲食習慣的改變，宮頸癌年輕化趨勢日漸明顯[2]。據(jù)調(diào)查顯示，全球每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)約52.9萬，死亡病例數(shù)約20.0萬，而中國每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)約13.2萬，死亡病例數(shù)約3.0萬[3]。目前臨床采用手術(shù)結(jié)合放化療的綜合治療方案，能夠縮小腫瘤病灶，改善臨床癥狀，延長患者生存時間，但仍有部分患者因遠處轉(zhuǎn)移或者局部復發(fā)導致治療失敗，預后結(jié)局差[4-5]。因此研究宮頸癌的發(fā)病機制對于尋找新的診治靶點有著重要意義。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)已被證實是宮頸癌的首要致病因素，與宮頸癌發(fā)生及進展關(guān)系十分密切[6]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白11(low density lipoprotein receptor-related protein 11，LRP11)是一種跨膜蛋白，可通過內(nèi)吞脂蛋白顆粒調(diào)控脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，還可參與血管通透性調(diào)節(jié)、細胞增殖、細胞侵襲等生命活動[7]。以往研究顯示，LRP11在乳腺癌、尿路上皮癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌等腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8]，但它是否參與宮頸癌的發(fā)生及進展尚不清楚。因此，本研究分析了LRP11在宮頸癌中的表達及其與HPV感染和腫瘤進展的關(guān)系，以期為宮頸癌的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

EMS5000系列振動組織切片機(湖南遠湘生物科技有限公司)；CKX31倒置顯微鏡(北京埃克森科技有限公司)；CytoFLEX S流式細胞儀(北京普瑞麥迪實驗室技術(shù)有限公司)；BIOTEK全自動酶標儀(上海必優(yōu)生物科技有限公司)；MiniChemiⅡ凝膠成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；兔抗人LRP11單克隆抗體(北京諾博萊德科技有限公司)；羊抗鼠IgG(廣州碩恒生物科技有限公司)；DAB顯色試劑盒(上海覓拓生物科技有限公司)；BCA試劑盒(北京綠百草科技發(fā)展有限公司)；一抗LRP11(上海武昊生物科技有限公司)；一抗β-actin(上海妍琦生物科技有限公司)；HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；超敏型ECL化學發(fā)光液(上海晶抗生物工程有限公司)；pEGFP-N1質(zhì)粒、pEGFP-N1-LRP11質(zhì)粒(湖南豐暉生物科技有限公司)；CCK-8增強型溶液(深圳市紐邦生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC(上海三抒生物科技有限公司)；PI染液(上海三抒生物科技有限公司)。

1.2 組織標本收集

收集2017年1月—2020年1月本院123例宮頸癌手術(shù)患者的癌組織及癌旁正常組織，其中HPV陰性25例，HPV陽性98例。入組標準：未經(jīng)過放療或化療等抗癌治療；未合并其他惡性腫瘤或影響生存期的全身性疾?。痪哂型暾牟±Y料和隨訪資料。其中癌組織中HPV陰性或HPV陽性通過PCR-DNA反向雜交實驗證實，操作如下：取石蠟包埋癌組織標本依據(jù)試劑盒說明書進行HPV-DNA提取、PCR擴增、雜交、洗膜、顯色。結(jié)果判讀陽性質(zhì)控品雜交膜條出現(xiàn)在HPV基因型位點或IC位點呈現(xiàn)藍色，其余位點都不顯色；陰性結(jié)果：IC位點和其余位點均不顯色。HPV檢測分型為高危型。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組

HPV陽性人宮頸癌細胞系Hela，購于上海北諾生物科技有限公司；HPV陰性人宮頸癌細胞系C33A，購于上海澳音生物科技有限公司；人正常宮頸上皮細胞系HUCECs，購于上海雅吉生物科技有限公司。3種細胞用含0.1 mmol/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于各實驗。

將Hela細胞分為對照組、空質(zhì)粒組、LRP11質(zhì)粒組，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明書，空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染8 μg pEGFP-N1質(zhì)粒，LRP11質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染8 μg pEGFP-N1-LRP11質(zhì)粒，對照組不進行任何轉(zhuǎn)染處理，完成上述操作后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學染色法檢測癌旁正常組織、HPV陰性宮頸癌組織、HPV陽性宮頸癌組織中LRP11蛋白表達水平。將各組織用EMS5000系列振動組織切片機4 μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復，PBS緩沖液漂洗，內(nèi)源性過氧化物酶滅活，加山羊血清封閉，滴加稀釋比例為1∶200的兔抗人LRP11單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，PBS漂洗，滴加稀釋比例為1∶400的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育20 min，PBS漂洗，使用DAB顯色試劑盒進行顯色5 min，PBS終止反應，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，中性樹脂固封劑封固，由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生在雙盲情況下應用顯微鏡觀察陽性細胞率和著色程度。參照董頔等[9]免疫組化評分標準，取兩項得分之積，最終得分0～3分判定為陰性，最終得分>3分判定為陽性。

1.5 Western blot法

采用Western blot法檢測HUCECs細胞、C33A細胞、Hela細胞中LRP11蛋白表達量。取培養(yǎng)的HUCECs細胞、C33A細胞、Hela細胞，用細胞裂解液裂解，抽提蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白水平，蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉溶液在搖床上室溫封閉2 h，加入一抗LRP11(1∶500)、一抗β-actin(1∶400)，4 ℃孵育過夜，用PBST洗滌3次，再加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶4 000)，室溫孵育2 h，用PBST洗滌3次，用超敏型ECL化學發(fā)光液檢測蛋白條帶，用MiniChemiⅡ凝膠成像儀采集圖像，用Image J軟件掃描灰度值，分析結(jié)果。

采用Western blot法檢測各組Hela細胞中LRP11蛋白表達量，取轉(zhuǎn)染后的各組Hela細胞，操作方法同上。

1.6 CCK8法

采用CCK8法檢測各組Hela細胞增殖率。取轉(zhuǎn)染后的各組Hela細胞，接種于96孔培養(yǎng)板(每孔100 μL培養(yǎng)基)，5×103個/孔細胞培養(yǎng)48 h，加入CCK8增強型溶液(每孔10 μL)，避光孵育2 h，在BIOTEK全自動酶標儀450 nm處測定吸光度值，計算Hela細胞增殖率，Hela細胞增殖率(%)=(吸光度值處理組/吸光度值對照組)×100%。

1.7 Transwell小室侵襲實驗

采用Transwell小室侵襲實驗檢測各組Hela細胞的侵襲能力。取轉(zhuǎn)染后的各組Hela細胞，制成細胞懸液，在Transwell小室的上室鋪入基質(zhì)膠(每孔60 μL，37 ℃成膠)，加入細胞懸液(1×103個/孔)，在Transwell小室的下室中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，棄掉上室液體，90%乙醇常溫固定30 min，風干之后用0.1%結(jié)晶紫常溫染色10 min，用PBS漂洗3次，在CKX31倒置顯微鏡下隨機選取4個視野進行拍照，并計算穿過小室膜的Hela細胞數(shù)。

1.8 流式細胞術(shù)

采用流式細胞術(shù)檢測各組Hela細胞的凋亡率。取轉(zhuǎn)染后的各組Hela細胞，用4℃預冷PBS溶液洗滌細胞3次，用1×Tris Buffer緩沖液(250 μL)重新懸浮細胞至1×109個/L，然后加入Annexin V-FITC(3 μL)、PI染液(10 μL)，充分混勻，避光反應15 min，用CytoFLEX S流式細胞儀檢測Hela細胞的凋亡率。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 癌旁正常組織、HPV陰性宮頸癌組織、HPV陽性宮頸癌組織中LRP11蛋白表達水平的比較

LRP11蛋白主要表達于細胞質(zhì)。LRP11在癌旁正常組織、HPV陰性宮頸癌組織、HPV陽性宮頸癌組織中陽性表達率分別為10.57%(13/123)、52.00%(13/25)、75.51%(74/98)，3組之間LRP11陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=96.830，P<0.001)，其中HPV陰性宮頸癌組織中LRP11陽性表達率高于癌旁正常組織(χ2=24.628，P<0.001)，HPV陽性宮頸癌組織LRP11陽性表達率高于癌旁正常組織(χ2=96.369，P<0.001)，HPV陽性宮頸癌組織LRP11陽性表達率高于HPV陰性宮頸癌組織(χ2=5.318，P=0.02；圖1)。

圖1 癌旁正常組織、HPV陰性宮頸癌組織、HPV陽性宮頸癌組織中LRP11蛋白表達水平的比較(免疫組化染色，400×)

2.2 HUCECs細胞、C33A細胞、Hela細胞中LRP11蛋白表達量的比較

HUCECs細胞、C33A細胞、Hela細胞中LRP11蛋白表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=22.810，P=0.002)，其中C33A細胞LRP11蛋白表達量高于HUCECs細胞(Q=4.033，P<0.01)，Hela細胞LRP11蛋白表達量高于HUCECs細胞(Q=9.514，P<0.01)，Hela細胞LRP11蛋白表達量高于C33A細胞(Q=5.481，P<0.01；圖2)。

圖2 HUCECs細胞、C33A細胞、Hela細胞中LRP11蛋白表達量的比較a為P<0.01，與HUCECs細胞比較；b為P<0.01，與C33A細胞比較。

2.3 各組Hela細胞中LRP11蛋白表達量的比較

LRP11質(zhì)粒組Hela細胞中的LRP11蛋白表達量較對照組和空質(zhì)粒組高，差異具有統(tǒng)計學意義(Q=6.992、6.912，P均<0.01)；空質(zhì)粒組Hela細胞中的LRP11蛋白表達量較對照組差異無統(tǒng)計學意義(Q=0.080，P>0.05；圖3)。

圖3 各組Hela細胞中LRP11蛋白表達量的比較a為P<0.05，與對照組和空質(zhì)粒組比較。

2.4 各組Hela細胞增殖率和凋亡率的比較

LRP11質(zhì)粒組Hela細胞增殖率較對照組和空質(zhì)粒組高，差異具有統(tǒng)計學意義(Q=43.075、42.568，P均<0.01)。LRP11質(zhì)粒組Hela細胞凋亡率較對照組和空質(zhì)粒組低，差異具有統(tǒng)計學意義(Q=9.868、10.541，P均<0.05)，空質(zhì)粒組Hela細胞增殖率和凋亡率較對照組差異無統(tǒng)計學意義(Q=0.507、0.672，P均>0.05；表1、圖4)。

表1 各組Hela細胞增殖率和凋亡率的比較 單位：%

圖4 各組Hela細胞凋亡情況的比較橫坐標為Annexin V/FITC染色；縱坐標為PI染色。Q1象限為機械性死亡細胞；Q2象限為凋亡晚期的細胞；Q3象限為正?；罴毎籕4象限為凋亡早期的細胞。

2.5 各組Hela細胞侵襲能力的比較

LRP11質(zhì)粒組穿過小室膜的Hela細胞數(shù)較對照組和空質(zhì)粒組高，差異具有統(tǒng)計學意義(Q=18.075、17.724，P均<0.01)；空質(zhì)粒組穿過小室膜的Hela細胞數(shù)較對照組差異無統(tǒng)計學意義(Q=0.351，P>0.05；表2、圖5)。

表2 各組Hela細胞侵襲能力的比較

圖5 各組Hela細胞侵襲能力的比較(結(jié)晶紫染色，100×)

3 討 論

早期宮頸癌通常無明顯癥狀和體征，隨著病情進展，根據(jù)癌灶累及范圍可出現(xiàn)陰道流血、下肢腫痛、腎盂積水、貧血、輸尿管梗阻等繼發(fā)性癥狀。據(jù)報道，晚期宮頸癌術(shù)后5年總生存率僅10%～20%[10]，故早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提升宮頸癌患者預后的關(guān)鍵。

HPV是一種球形DNA病毒，屬乳多空病毒科，感染途徑包括性傳播、醫(yī)源性感染、母嬰傳播等，可引起人體皮膚或黏膜的鱗狀上皮增殖，引發(fā)上皮良、惡性腫瘤，如尖銳濕疣、肛門癌、宮頸癌等，其中以宮頸癌為常見。報道顯示，HPV在14～59歲人群中的總感染率為26.8%[11]，HPV感染是導致宮頸癌的主要生物學因素，HPV的癌基因整合宮頸上皮細胞后，可產(chǎn)生大量E7癌蛋白，E7與抑癌基因Rb結(jié)合后可引起細胞增殖調(diào)控障礙，誘發(fā)宮頸癌細胞異常增殖。在本研究中，免疫組織化學染色實驗和Western blot實驗均提示LRP11在宮頸癌中呈高表達，且LRP11表達與HPV感染有一定相關(guān)性，表明LRP11和HPV可能共同參與了宮頸癌的發(fā)病。LRP11為LRP家族中的重要一員，是一種細胞表面蛋白，可通過與溶酶體結(jié)合而促進溶酶體降解，調(diào)控多個分子表達水平，還可參與多個細胞生理事件，如細胞增殖、細胞遷移、血管生成調(diào)節(jié)、凋亡細胞信號調(diào)節(jié)、血脂動態(tài)平衡調(diào)節(jié)等。此外，LRP11可通過內(nèi)化某些基質(zhì)蛋白和生長因子而調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，進而參與調(diào)節(jié)與腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導。LRP11也是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的重要因素之一，可通過調(diào)節(jié)細胞骨架組織、控制局灶性黏附成分、調(diào)節(jié)整合素內(nèi)吞循環(huán)，強化惡性細胞侵襲性表型，促進惡性腫瘤進展[12]。本研究Western blot實驗顯示，LRP11質(zhì)粒組LRP11蛋白表達量較對照組和空質(zhì)粒組高，而對照組和空質(zhì)粒組之間的LRP11蛋白表達量無明顯差異，提示LRP11過表達載體構(gòu)建成功。接下來通過CCK8實驗、Transwell小室侵襲實驗、流式細胞術(shù)實驗發(fā)現(xiàn)，LRP11質(zhì)粒組Hela細胞增殖率、穿過小室膜的Hela細胞數(shù)、LRP11蛋白表達量較對照組和空質(zhì)粒組高，LRP11質(zhì)粒組Hela細胞凋亡率較對照組和空質(zhì)粒組低，提示LRP11過表達可促進宮頸癌細胞增殖和侵襲，抑制其凋亡，以加速癌細胞進展，這與以下研究報道有相似之處。研究發(fā)現(xiàn)，LRP11可通過激活Janus激酶2(janus kinase 2，JAK2)/信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄活化因子3(Signal transduction factor and activator of transcription 3，STAT3)通路而強化纖溶酶原激活物抑制因子1(Plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)的促細胞遷移活性[13]。研究提示，LRP11可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo protease，MMP)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達水平而促進癌細胞侵襲和遷移[14]。報道指出，LRP11可通過激活無翅型MMTV整合位點家族成員蛋白(Wnt)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路，加速細胞周期進程，促進腫瘤發(fā)展[15]。學者發(fā)現(xiàn)，LRP11在乳腺癌中呈高水平且與癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。研究顯示，LRP11與甲狀腺癌患者癌組織中的細胞增殖抗原Ki-67具有很強的正相關(guān)性，LRP11和Ki-67表達水平聯(lián)合檢測對甲狀腺癌的臨床診療有重要意義[17]。臨床資料顯示，LRP11在宮頸癌患者中的表達水平明顯上調(diào)，其表達水平與宮頸癌患者總生存時間呈負相關(guān)[18]。由此表明LRP11在包括宮頸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)病過程中具有重要作用，臨床應加以關(guān)注，以探索出新的宮頸癌預防及治療靶點。

綜上所述，LRP11在宮頸癌中呈高表達，宮頸癌中LRP11表達與HPV感染有一定相關(guān)性；LRP11過表達可促進宮頸癌細胞增殖和侵襲，抑制其凋亡，以加速腫瘤進展。但其機制尚不清楚，有待進一步研究。