張紅玲， 蔡鵬， 熊玲， 羅文鈺， 楊美慶， 徐榮蘭， 王啟燕， 任崢， 季晶焱， 黃江

(貴州醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)是一類在人類基因組中分布較廣的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)串聯(lián)重復(fù)序列，由于其等位基因長(zhǎng)度較短、重復(fù)次數(shù)較少，具有高鑒別能力，因此是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中親權(quán)鑒定和個(gè)體識(shí)別、以及群體遺傳研究常用的遺傳標(biāo)記[1]。目前法醫(yī)物證檢驗(yàn)中通用的試劑盒所包含的基因座數(shù)目通常在20個(gè)左右，這些試劑盒以DNA檢索系統(tǒng)(combined DNA index system，CODIS)中的基因座為基礎(chǔ)，在疑難案件或復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定時(shí)，常常需要增加檢測(cè)的基因座[2]。目前已有學(xué)者利用AGCU21+1熒光檢測(cè)試劑盒對(duì)部分人群進(jìn)行了研究，表明不同民族不同地理位置人群STR基因頻率有所不同[3-11]，而對(duì)貴州地區(qū)人群的非CODIS STR基因座未見報(bào)道。因此，本文利用該試劑盒獲取貴州地區(qū)漢族人群的21個(gè)非CODIS系統(tǒng)STR群體遺傳學(xué)參數(shù)，為法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定和個(gè)體識(shí)別提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源 從學(xué)校法醫(yī)司法鑒定中心日常檢案中篩選出301例貴州漢族無關(guān)個(gè)體血樣。所有檢材均經(jīng)過知情同意原則，人體倫理道德由學(xué)校人體試驗(yàn)倫理委員會(huì)審批(NO.201974)。

1.1.2主要試劑和儀器 AGCU21+1熒光檢測(cè)試劑盒(無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司)，Veriti型基因擴(kuò)增儀和3500型全自動(dòng)遺傳分析儀(美國(guó) AB公司)。

1.2 方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增按照AGCU21+1熒光檢測(cè)試劑盒用戶手冊(cè)進(jìn)行。反應(yīng)體系為10 μL：Reaction Mix 4.0 μL，Primers21+12 μL，熱啟動(dòng)C-Taq酶(5 U/μL)0.3 μL，ddH2O 3.7 μL，模板 DNA為直徑1 mm的紙片。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)；90 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán)，60 ℃延伸60 min。采用3500遺傳分析儀對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，GeneMapper ID-X1.3軟件對(duì)STR基因分型結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用 Modified-Powerstates軟件包[12]，獲得各基因座的等位基因頻率、雜合度(heterozygosity，H)、匹配概率(matching probability，PM)、個(gè)體識(shí)別率(power of discrimination，DP)、非父排除率(power of exclusion，PE)、多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)；累積個(gè)體識(shí)別能力(total discrimination power，TDP)和累積非父排除率(combined power of exclusion，CPE)，以及各基因座Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。應(yīng)用Genepop軟件(https://genepop.curtin.edu.au/genepop_op2.html)，對(duì)兩兩基因座進(jìn)行連鎖不平衡分析。選擇7個(gè)地區(qū)的漢族人群作為參考[13-19]，基于各人群基因頻率，應(yīng)用MultiVariate Statistical Package(MVSP)軟件對(duì)8個(gè)人群進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)，并應(yīng)用R對(duì)PCA結(jié)果進(jìn)行圖示化。應(yīng)用GENETIC DISTANCE AND PHYLOGENETIC ANALYSIS(DISPAN)軟件計(jì)算8個(gè)人群之間的Nei氏遺傳距離(Nei’s gentic distance，DA)值，基于DA值應(yīng)用MEGA 7.0軟件Neighbor-Joining(N-J)法構(gòu)建8個(gè)地區(qū)漢族人群系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 基因頻率

貴州漢族301例無關(guān)個(gè)體的21個(gè)常染色體STR基因座的等位基因頻率分布結(jié)果顯示，各基因座頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)；21個(gè)基因座位點(diǎn)兩兩比較均未見連鎖不平衡。見表1。

表1 貴州漢族21個(gè)常染色體STR的等位基因頻率Tab.1 Allelic frequencies for the 21 STR loci in Guizhou Han people

2.2 遺傳學(xué)參數(shù)

貴州漢族301例個(gè)體的21個(gè)常染色體STR基因座共檢測(cè)出了157個(gè)等位基因，436種基因型；21個(gè)常染色體的 STR 基因座遺傳多態(tài)性均較高，H介于0.584 7(D1S1627)～0.807 3(D2S441)，PM介于0.052 6(D19S433)～0.226 8(D1S1627)，DP介于0.773 2(D1S1627)～0.947 4(D19S433)，PE介于0.272 9(D1S1627)～0.586 7(D22S1045)，PIC介于0.533 2(D1S1627)～0.803 0(D19S433)；TDP為1-4.645 5×10-20，CPE為0.999 998 822。貴州漢族人群21個(gè)STR基因座的遺傳學(xué)參數(shù)見表2。

表2 貴州漢族人群21個(gè)STR基因座的遺傳學(xué)參數(shù)Tab.2 Genetic parameters for the 21 STR loci in Guizhou Han peoole

2.3 貴州漢族與其他地區(qū)漢族人群比較

基于基因頻率進(jìn)行主成分分析結(jié)果顯示(圖1)，其中PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為75%和11.5%，兩個(gè)成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為86.5%，解釋了8個(gè)人群間基因頻率遺傳結(jié)構(gòu)差異約87%的信息；從主成分分析散點(diǎn)圖中可以看出，貴州、北方、關(guān)中、河南、湖南及浙江漢族6個(gè)人群分布較為集中，位于PCA圖的左下方；而成都和寧夏漢族與其他6個(gè)漢族人群距離較遠(yuǎn)，分別位于PCA圖的左上方以及右下方；在8個(gè)漢族人群中，本文研究的貴州與湖南漢族人群距離最近，與寧夏漢族人群距離最遠(yuǎn)。根據(jù)遺傳距離DA構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2)，除貴州和湖南漢族外，其余6個(gè)漢族人群?jiǎn)为?dú)聚為一支。

圖1 貴州與其他7個(gè)地區(qū)漢族人群的主成分分析圖Fig.1 PCA of Guizhou Han and 7 Chinese Han people of other areas

圖2 貴州與其他7個(gè)地區(qū)漢族人群N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 N-J phylogenetic tree between Guizhou Han and 7 Chinese Han people of other areas

3 討論

1990年起，美國(guó)聯(lián)邦調(diào)查局(Federal Bureau of Investigation，F(xiàn)BI)為了搜尋犯罪嫌疑人及串、并案的偵察，開始實(shí)行聯(lián)合CODIS計(jì)劃，篩選了13個(gè)常染色體STR基因座作為核心基因座[20-21]。目前，常染色體STR遺傳標(biāo)記在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中已得到廣泛應(yīng)用。為保證DNA數(shù)據(jù)的有效性、異地查詢及DNA實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的需要，大部分商品化的STR試劑盒均以這13個(gè)基因座為基礎(chǔ)構(gòu)建，但CODIS系統(tǒng)中部分基因座在我國(guó)的人群中的非父排除概率及個(gè)人識(shí)別能力較低，而影響了整個(gè)系統(tǒng)效能，為此需要選擇一些非CODIS系統(tǒng)的基因座作為這些商品化試劑盒的有效補(bǔ)充。

為了滿足標(biāo)準(zhǔn)化、數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)及實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的要求，建議增加的基因座選用商品化的試劑盒，本文對(duì)AGCU21+1熒光檢測(cè)試劑盒中包含的D6S474等21個(gè)常染色體 STR 基因座進(jìn)行基因分型結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明21個(gè)常染色體STR基因座，均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。除了D1S1627、D1GATA113、D1S1677、D9S1122、D17S1301及D6S474這6個(gè)基因座為中等鑒別能力的基因座外，其余的基因座均屬于高度多態(tài)性基因座，其TDP為1-4.645 5×10-20，CPE為0.999 998 822。結(jié)合課題組前期對(duì)包含CODIS系統(tǒng)的22個(gè)常染色體STR基因座(PowerPlex Fusion試劑盒)的研究[22]，2個(gè)復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)的TDP可達(dá)到1-2.424 7×10-41，CPE可達(dá)到0.999 999 999 999 962，可以滿足在疑難案件或復(fù)雜親緣關(guān)系鑒定的需要。

有研究表明，不同地理人群之間具有不同的遺傳結(jié)構(gòu)[23-25]，為了明確貴州漢族與其他地區(qū)漢族的遺傳關(guān)系，本研究選擇了已報(bào)道的中國(guó)7個(gè)地區(qū)的漢族與貴州漢族進(jìn)行組成分分析和遺傳距離DA分析，對(duì)于8個(gè)地區(qū)漢族人群的比較，主成分分析圖及系統(tǒng)發(fā)育樹均顯示貴州漢族與湖南漢族遺傳關(guān)系最近，與北方的寧夏漢族遺傳關(guān)系最遠(yuǎn)，這與地理位置相對(duì)應(yīng)。處于南方地理位置的成都及浙江漢族相較于北方河南漢族與貴州漢族的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而河南漢族、北方漢族、關(guān)中漢族與寧夏漢族雖地理位置同處于北方，但寧夏漢族與其余北方漢族關(guān)系較遠(yuǎn)。這也說明了漢族人群因定居地不同，親緣關(guān)系也不同。漢族作為我國(guó)乃至世界人口規(guī)模最大的群體，居住地理范圍廣，地域差距大，生活習(xí)慣各異，各地方言多樣，因?yàn)?zāi)害或戰(zhàn)爭(zhēng)等原因有過大規(guī)模及頻繁的人群遷移，各地的漢族人群相互或與其他民族進(jìn)行基因的融合。通過分析不同地區(qū)的漢族群體遺傳多態(tài)性的差異及遺傳結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)于探索該人群的民族起源及遷移提供了分子人類學(xué)方面的科學(xué)依據(jù)及線索，有助于推進(jìn)法醫(yī)學(xué)親緣關(guān)系及個(gè)人識(shí)別方面的研究。