吳坤， 馬曉琳， 張迎春， 鄧思波， 黃敏慧， 吳建偉， 陳崢宏**， 王濤**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.濟(jì)南金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心， 山東 濟(jì)南 250000)

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是廣泛存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界微生物侵害的一類小分子多肽，是生物固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，AMPs除了具有抑制細(xì)菌、病毒等病原微生物作用外，對腫瘤細(xì)胞也具有較強(qiáng)的抑制活性[3-6]，而且對機(jī)體正常組織細(xì)胞的毒副作用較低[7-8]，因此具有抗腫瘤藥物開發(fā)的潛力。家蠅抗真菌肽-1A (Muscadomesticaantifungal peptide-1A，MAF-1A) 是來源于家蠅幼蟲的小分子陽離子活性多肽，由26個(gè)氨基酸殘基組成[9]。有研究報(bào)道，MAF-1A能殺傷真菌、病毒等致病性微生物[10-11]；課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MAF-1A能對人肝癌HepG2產(chǎn)生抑制作用，且對人正常肝細(xì)胞LO2和紅細(xì)胞無明顯毒性作用，具有進(jìn)一步研究開發(fā)的價(jià)值[12]。但MAF-1A抑制HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚，本研究旨在探討MAF-1A對HepG2細(xì)胞產(chǎn)生抑殺作用的可能因素，為MAF-1A的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株和主要試劑 人肝癌細(xì)胞HepG2由貴州醫(yī)科大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM) 及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；美國GIBCO)，胎牛血清(杭州四季青)，活性氧(reactive oxygen species，ROS) 檢測試劑盒及Annexin V-FITC試劑盒(北京索萊寶)，細(xì)胞周期檢測試劑盒及線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天)。

1.1.2主要儀器 Novo Cyte流式細(xì)胞儀(杭州艾森)，H-600-4透射電子顯微鏡(日本日立高新)，XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光學(xué))，MCO-5M CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)及L500臺式低速離心機(jī)(湖南湘儀)。

1.2 方法

1.2.1MAF-1A儲備液的制備 按文獻(xiàn)[13]方法，采用原核載體串聯(lián)表達(dá)MAF-1A，鎳柱親和層析純化、脫鹽濃縮制備MAF-1A，使其儲備液濃度為5 000 mg/L，分裝后置于-80 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基，含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，培養(yǎng)基添加終濃度100 000 U/L青霉素及100 mg/L的鏈霉素；將細(xì)胞置于5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，按照1 ∶3的比列傳代，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，置5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；0、50 及100 mg/L的MAF-1A分別處理24 h后收集細(xì)胞，3%戊二醛固定、丙酮逐級脫水、樣品包埋，切完片后先后用醋酸鈾和枸櫞酸染色，于透射電鏡(6 000×)下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)ROS 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，每組3個(gè)復(fù)孔，5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；0、100、200及400 mg/L的MAF-1A分別處理24 h。按試劑盒說明書方法，分別以碘化丙啶(propidium lodide，PI)、Annexin V-PI試劑、DCFH-DA(10 μmol/L)溶液處理細(xì)胞后，再用流式細(xì)胞儀分別檢測HepG2細(xì)胞的周期、凋亡及細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。

1.2.5JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，放入5%CO2的37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h； 以終濃度為0、100、200及400 mg/L的MAF-1A處理細(xì)胞24 h，加入JC-1染色工作液混勻，37 ℃孵育20 min，不含胎牛血清的培養(yǎng)基洗滌3次，胰酶消化，1 000 r/min離心3 min收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測HepG2細(xì)胞線粒體膜電位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

0 mg/L MAF-1A組 50 mg/L MAF-1A組 100 mg/L MAF-1A組注：黑色箭頭分別表示細(xì)胞膜出芽、核固縮，凋亡小體，白色箭頭分別表示染色質(zhì)出現(xiàn)邊集，胞漿固縮、空泡化。圖1 不同濃度MAF-1A對HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響(6 000×)Fig.1 Effects of different concentrations of MAF-1A on the morphology of HepG2(6 000×)

2 結(jié)果

2.1 電鏡觀察

透射電鏡觀察可見，經(jīng)不同濃度的MAF-1A作用后，HepG2細(xì)胞體積較對照組縮小，細(xì)胞膜產(chǎn)生出芽現(xiàn)象，核固縮，有凋亡小體形成；染色質(zhì)出現(xiàn)邊集，胞漿固縮、空泡化；而陰性對照組細(xì)胞規(guī)則，胞膜未見形態(tài)變化，未見核固縮、胞漿濃縮等現(xiàn)象。見圖1。

2.2 細(xì)胞周期

檢測結(jié)果顯示，與0 mg/L組相比，MAF-1A各濃度組中G0/G1期的HepG2細(xì)胞比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 不同濃度MAF-1A對HepG2細(xì)胞周期的影響Tab.1 Effects of different concentrations of MAF-1A on cell cycle of

2.3 細(xì)胞凋亡率

100、200及400 mg/L的MAF-1A作用24 h后，HepG2細(xì)胞凋亡率較0 mg/L MAF-1A組明顯增大，且凋亡率隨MAF-1A濃度的升高而增加(P<0.01)。見圖2。

注：A為凋亡細(xì)胞檢測結(jié)果，B為細(xì)胞凋亡率的定量結(jié)果；(1)與0 mg/L MAF-1A組比較，P<0.01。圖2 不同濃度MAF-1A對HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of different concentrations of MAF-1A on apoptosis of HepG2 cells

2.4 線粒體膜電位

100、200及400 mg/L 的MAF-1A分別作用24 h后，與對照組(0 mg/L組)相比，HepG2細(xì)胞的線粒體膜電位可降低，并且隨著MAF-1A濃度的升高，出現(xiàn)線粒體膜電位下降細(xì)胞數(shù)的占比逐漸增高。見圖3。

0 mg/L MAF-1A組 100 mg/L MAF-1A組 200 mg/L MAF-1A組 400 mg/L MAF-1A組注: 正常線粒體膜電位細(xì)胞分布于右上Q2-2區(qū)域，線粒體膜電位下降的細(xì)胞分布在右下Q2-4區(qū)域。圖3 不同濃度MAF-1A對HepG2細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.3 Effects of different concentrations of MAF-1A on mitochondrial membrane potential of HepG2 cells

2.5 ROS

結(jié)果顯示，與0 mg/L MAF-1A組相比，高濃度MAF-1A(400 mg/L)組HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高(P<0.01)，但中、低濃度MAF-1A(100和200 mg/L)組ROS水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

注：A為細(xì)胞內(nèi)ROS檢測結(jié)果，B為細(xì)胞內(nèi)ROS的定量表達(dá)；(1)與0 mg/L MAF-1A組比較，P<0.01。圖4 不同濃度MAF-1A對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響Fig.4 Effects of different concentrations of MAF-1A on ROS in HepG2 cells

3 討論

目前研究認(rèn)為，AMPs的抗腫瘤機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抗血管形成、溶膜作用及改變細(xì)胞離子通道等[14-17]，其中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是AMPs抑殺腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制之 一[18]。細(xì)胞調(diào)亡是細(xì)胞為更好地適應(yīng)生長環(huán)境而發(fā)生的自發(fā)的程序性死亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)[19-20]。文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞在調(diào)亡過程中可出現(xiàn)細(xì)胞膜皺縮、細(xì)胞膜出芽、細(xì)胞核邊集、細(xì)胞器的碎片及染色質(zhì)的固縮或碎片等特征性的形態(tài)學(xué)變化[21-22]。本研究的透射電鏡檢測結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞經(jīng)MAF-1A作用后，產(chǎn)生了染色質(zhì)聚集或邊集，核固縮，形成凋亡小體等細(xì)胞凋亡的特征性變化，提示MAF-1A抑制腫瘤活性機(jī)制作用可能與細(xì)胞凋亡相關(guān)；進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，不同濃度MAF-1A均可促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡，且濃度越高，細(xì)胞凋亡率越大(P<0.01)，表明MAF-1A可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的發(fā)生，提示MAF-1A可以通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，從而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞凋亡過程受多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，隨著對凋亡機(jī)制研究的深入，普遍認(rèn)為線粒體是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，而線粒體膜電位降低是細(xì)胞發(fā)生凋亡最早期的變化，一旦線粒體膜電位出現(xiàn)降低，細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[23]。有研究認(rèn)為，ROS是細(xì)胞新陳代謝的產(chǎn)物，在細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用[24]。文獻(xiàn)報(bào)道，Cecropin A及Tomentosin可通過下調(diào)線粒體膜電位和增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡[25]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，在MAF-1A作用下 HepG2細(xì)胞線粒體膜電位降低，且高濃度MAF-1A(400 mg/L)組HepG2細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯升高，表明MAF-1A可以下調(diào)HepG2細(xì)胞的線粒體膜電位，并且在一定濃度下可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS大量產(chǎn)生，提示下調(diào)線粒體膜電位及促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生可能是MAF-1A誘導(dǎo) HepG2 細(xì)胞凋亡的原因。

通常認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期包括2個(gè)時(shí)期，即有絲分裂間期和有絲分裂期(M期)[26]。有絲分裂間期又可劃分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)和DNA合成后期(G2期)，細(xì)胞還未進(jìn)入分裂期時(shí)，處于靜止的狀態(tài)稱G0期[27]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞周期中的任何一個(gè)時(shí)期受到阻滯，可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖受阻[28]。實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，來源于蜘蛛的毒液肽可通過阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制HeLa細(xì)胞的生長[29]。本研究的細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，不同濃度的MAF-1A均能使HepG2的G0/G1期細(xì)胞所占比例升高(P<0.01)，表明MAF-1A可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

綜上所述，本研究認(rèn)為MAF-1A可能通過促進(jìn)線粒體膜電位下調(diào)、增加細(xì)胞內(nèi)ROS含量所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以及阻滯細(xì)胞周期來發(fā)揮抑制HepG2細(xì)胞的作用。