馬貴蘭， 譚艷， 包倫敏， 蔣紅梅*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 湖北 武漢 430000)

樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)是參與調(diào)節(jié)免疫刺激和耐受的重要抗原提呈細(xì)胞[1-3]。近年的研究表明，DC的類(lèi)型不同從而誘導(dǎo)T細(xì)胞分化的方向不同，使免疫反應(yīng)向不同甚至相反的方向發(fā)展，如成熟DC可刺激T細(xì)胞的免疫反應(yīng)性，打破機(jī)體自身免疫穩(wěn)態(tài)；未成熟DC因低表達(dá)簇分化抗原80(cluster of differentiation 80，CD80)、簇分化抗原86(cluster of differentiation 86，CD86)等可誘導(dǎo)T細(xì)胞低反應(yīng)性或失活，故被稱(chēng)為“耐受性DC(dendritic cells, tolDC)”[4-6]，這為誘導(dǎo)免疫耐受的建立提供了新方向。寡核苷酸誘騙劑(oligodeoxynucleotides decoy, ODN Decoy)策略是近年來(lái)倍受關(guān)注的抗基因策略[7]。ODN Decoy與機(jī)體內(nèi)一種不可或缺的核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)結(jié)合[8]，導(dǎo)致NF-κB促進(jìn)靶基因激活被阻止，從而抑制DC成熟而獲得tolDC，且抑制作用具有很高的穩(wěn)定性[9]。臨床上用免疫抑制劑抑制DC成熟的作用弱且不完全，又容易被細(xì)胞因子所逆轉(zhuǎn)，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)往往因腺病毒等載體對(duì)DC的刺激作用而抵消導(dǎo)入基因的效應(yīng)[7]，與免疫抑制劑、轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制DC成熟的策略相比，NF-κB寡核苷酸誘騙劑(oligodeoxynucleotides decoy，ODN Decoy)抑制DC成熟所具有的明顯優(yōu)勢(shì)，然而DC屬于高分化的非增殖細(xì)胞，不能進(jìn)行傳代培養(yǎng)，其生存時(shí)間比較短，數(shù)量極少，體外往往難以獲取到足夠數(shù)量的高質(zhì)量DC[10]。因此，本研究旨在通過(guò)NF-κB ODN Decoy誘導(dǎo)培養(yǎng)tolDC，并對(duì)其進(jìn)行純度、成熟度、細(xì)胞活力鑒定以及形態(tài)和耐受性分析，為后續(xù)研究tolDC在機(jī)體中免疫抑制機(jī)制奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動(dòng)物來(lái)源 6～7周齡無(wú)特殊病原體雄性Sprague Dawley(SD)和Wistar大鼠各10只(體質(zhì)量180～200 g)購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～26 ℃、濕度40%～70%的動(dòng)物飼養(yǎng)室適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2主要試劑和儀器 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)和白細(xì)胞介素4(interleuk-in-4, IL-4；杭州佑研生物)，PE標(biāo)記的抗大鼠CD80單克隆抗體(PE conjugated anti-rat CD80，PE-CD80)、FITC標(biāo)記的抗大鼠CD86單克隆抗體(FITC conjugated anti-rat CD86，F(xiàn)ITC-CD86)及Alexa-Fluor 647標(biāo)記的抗大鼠OX-62單克隆抗體(Alexa-Fluor 647 anti-rat OX-62，Alexa-Fluor 647-OX-62；北京達(dá)科為生物)，胎牛血清、大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞分離液和4%臺(tái)盼蘭溶液(貴州沃爾盛生物)，RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素和鏈霉素混合液、脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、紅細(xì)胞裂解液及吉姆薩原液(貴陽(yáng)超研生物)，TE2000-U型倒置顯微鏡(日本Nikon)，Navios型流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼)，Series Ⅱ Water Jacket型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)賽默飛)，NF-κB ODN Decoy參考文獻(xiàn)[11]中使用的序列，正義序列為AGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCC，下劃線標(biāo)出的堿基序列表示與NF-κB特異性結(jié)合的位點(diǎn)，委托上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1DC的制備及分組 參考文獻(xiàn)[12]的方法并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行改進(jìn)，麻醉處死SD大鼠，手術(shù)剪剝離脛骨上的組織，剔出脛骨并置于75%酒精的離心管中浸泡5 min，用無(wú)菌已制冷磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗脛骨10次，去除脛骨兩端，用裝有已制冷PBS 10 mL的注射器反復(fù)沖洗骨髓腔；將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到200目過(guò)濾器上過(guò)濾，細(xì)胞懸液1 500 r/min離心5 min，裂解紅細(xì)胞，PBS洗滌2次，對(duì)獲得的細(xì)胞沉淀用RPMI1640培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞調(diào)為1×109個(gè)/L，將所得細(xì)胞懸液于6孔板中鋪板后轉(zhuǎn)移到CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5 h，加適量的預(yù)熱PBS靜置漂洗。每孔加RPMI1640完全培養(yǎng)基2 mL，GM-CSF 3×107μg/L，IL-4 2×107μg/L。將DC分為Control-DC組(添加IL-4、GM-CSF定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng))、Decoy-DC組(Control-DC組基礎(chǔ)上加5 μmol/L NF-κB ODN Decoy共培養(yǎng))、LPS-DC組(培養(yǎng)初加GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，第7天加LPS 10 μg/L刺激)及LPS-Decoy-DC組(Decoy-DC組細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)加10 μg/L LPS) 。培養(yǎng)第3天于6孔板中加RPMI1640完全培養(yǎng)基1 mL/孔，第6天進(jìn)行半量換液，并補(bǔ)充相應(yīng)的細(xì)胞因子，第8天即可獲得DC。

1.2.2倒置顯微鏡和吉姆薩染色觀察DC形態(tài) 倒置顯微鏡觀察Control-DC組和Decoy-DC組SD大鼠骨髓細(xì)胞提取當(dāng)天、培養(yǎng)第4～8天DC及LPS-DC組和LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)第8天DC的細(xì)胞形狀、體積、表面突起及集落等。收集“1.2.1”項(xiàng)下培養(yǎng)第8天的Control-DC組和Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC按吉姆薩染色說(shuō)明進(jìn)行染色并觀察DC的形態(tài)特征。

1.2.3檢測(cè)DC細(xì)胞活力 收集“1.2.1”項(xiàng)下Decoy-DC組SD大鼠骨髓細(xì)胞提取當(dāng)天和培養(yǎng)第8天DC懸液，細(xì)胞懸液與染色液(臺(tái)盼藍(lán)染色法)體積比按9 ∶1混勻(終濃度0.04%)，染色3 min，取1滴染色后的細(xì)胞懸液置玻片中央，蓋上蓋玻片后盡快于鏡下觀察并計(jì)數(shù)藍(lán)色死細(xì)胞數(shù)(N1)和無(wú)色透明的活細(xì)胞數(shù)(N2) ，計(jì)算細(xì)胞存活率[細(xì)胞存活率(%)=N2/(N2+N1)×100%]。

1.2.4檢測(cè)DC免疫表型 收集“1.2.1”項(xiàng)下培養(yǎng)至第8天的各組6孔板中4組SD大鼠骨髓來(lái)源的DC，DC調(diào)為1×109個(gè)/L，PBS清洗后加 PBS 100 μL重懸，加PE-CD80、FITC-CD86及Alexa-Fluor 647-OX-62，4 ℃避光孵育40 min，PBS漂洗、重懸，流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)3次獨(dú)立培養(yǎng)SD大鼠骨髓DC的免疫表型。

1.2.5淋巴細(xì)胞和刺激細(xì)胞的制備 麻醉處死Wistar大鼠，迅速取脾臟置于無(wú)菌預(yù)冷RPMI1640培養(yǎng)基的10 mL離心管，PBS沖洗，Ⅳ型膠原酶消化，200目過(guò)濾器過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清后裂解紅細(xì)胞，適量含2%胎牛血清的PBS洗細(xì)胞1次，通過(guò)大鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，取分離出來(lái)的單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗2次，將細(xì)胞調(diào)為1×109個(gè)/L，所得的淋巴細(xì)胞即為反應(yīng)細(xì)胞。依次在“1.2.1”項(xiàng)下培養(yǎng)第8天的Control-DC組、Decoy-DC組、LPS-DC組及LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC中加絲裂霉素C 25 mg/L，37 ℃處理30 min，PBS洗3遍，將DC調(diào)為2×108個(gè)/L作為刺激細(xì)胞。

1.2.6混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)分為空白對(duì)照組(單獨(dú)加淋巴細(xì)胞)、Control-DC組、Decoy-DC組、LPS-DC組及LPS-Decoy-DC組。調(diào)整刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞比例為1 ∶5，依次在96孔板中分別加上述處理刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞(100 μL/孔)，每組中分別作相互獨(dú)立的6孔重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)68 h，加臨用時(shí)配置的噻唑藍(lán)20 μL/孔后培養(yǎng)4 h，棄上清，加二甲基亞砜100 μL/孔稍振蕩待產(chǎn)物充分溶解，酶標(biāo)儀上測(cè)490 nm處光密度(optical density，OD490)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DC組織學(xué)觀察

SD大鼠骨髓細(xì)胞提取當(dāng)天呈單個(gè)核細(xì)胞形態(tài)，第4天形態(tài)明顯變化，第8天Control-DC組SD大鼠骨髓DC集落較Decoy-DC組大，LPS作用Control-DC組SD大鼠骨髓DC后發(fā)現(xiàn)DC細(xì)胞集落變小、表面突起增多且明顯多于其他組，但Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC形態(tài)無(wú)明顯差異、表面突起較少見(jiàn)(圖1)；收集培養(yǎng)第8天的Control-DC組和Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC進(jìn)行吉姆薩染色，Control-DC組DC周邊典型突起清晰可見(jiàn)，且較Decoy-DC組突起長(zhǎng)而大(圖2)。

注：A、C、E為Decoy-DC組，B、D、F為Control-DC組，G為L(zhǎng)PS-Decoy-DC組，H為L(zhǎng)PS-Control-DC組圖1 SD大鼠骨髓不同培養(yǎng)時(shí)期的DC(200×)Fig.1 DC of SD rat bone marrow in different culture periods(200×)

Decoy-DC組 Control-DC組圖2 SD大鼠骨髓DC吉姆薩染色(1 000×)Fig.2 Giemsa staining of DC derived from SD rat bone marrow(1 000×)

表1 Wistar大鼠脾臟淋巴細(xì)胞和SD大鼠骨髓源性DC混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)Tab.1 Mixed lymphocyte reaction of Wistar rat spleen lymphocytes and SD rat bone

2.2 DC細(xì)胞活力評(píng)估

Decoy-DC組SD大鼠骨髓細(xì)胞剛提取單個(gè)核細(xì)胞和培養(yǎng)至第8天的DC臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果顯示未被臺(tái)盼藍(lán)染色的活細(xì)胞均>95%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞活力觀察(100×)Fig.3 Observation on cell viability of SD rat bone marrow DC stained with trypan blue in Decoy-DC group(100×)

2.3 DC表面OX-62的表達(dá)

4組SD大鼠骨髓DC的OX-62陽(yáng)性表達(dá)率為95%～100%，平均98.225%，但各組DC間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖4。

注：A為DC表面OX-62表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，B為DC表面OX-62的定量表達(dá)。圖4 SD大鼠骨髓DC特異性標(biāo)志OX-62流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果Fig.4 Flow cytometry results of SD rat bone marrow DC specific marker OX-62

2.4 DC表面CD80和CD86表達(dá)

Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC的CD80、CD86陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度低于Control-DC組(P<0.05)，LPS-DC組SD大鼠骨髓DC的CD80、CD86陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度高于LPS-Decoy-DC組(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：A為DC表面CD80和CD86表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，B和C分別為DC表面CD80和CD86平均熒光強(qiáng)度的定量結(jié)果，D和E分別為DC表面CD80和CD86陽(yáng)性率的定量結(jié)果；(1)與Control-DC組比較，P<0.05；(2)與LPS-DC組比較，P<0.05。圖5 SD大鼠骨髓DC表面CD80和CD86表達(dá)Fig.5 Expression of CD80 and CD86 on the surface of SD rat bone marrow DC

2.5 淋巴細(xì)胞增殖

Decoy-DC組Wistar大鼠脾臟淋巴細(xì)胞和SD大鼠骨髓源性的DC混合淋巴細(xì)胞OD490低于Control-DC組(P<0.05)；Decoy-DC組經(jīng)LPS作用，Wistar大鼠脾臟淋巴細(xì)胞和SD大鼠骨髓源性的DC混合淋巴細(xì)胞OD490增高，但仍低于LPS-DC組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

DC是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)成分，來(lái)源于骨髓造血祖細(xì)胞，可精確、特異地指導(dǎo)免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的反應(yīng)，也是宿主免疫反應(yīng)的組成部分，被認(rèn)為是免疫應(yīng)答的典型前哨細(xì)胞,在先天性免疫和適應(yīng)性免疫之間發(fā)揮著橋梁的作用，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[13-16]。目前研究中，提取大鼠DC主要源于骨髓和外周血，雖然外周血與骨髓相比取材較方便，但是獲取的DC純度低[17]，因此相關(guān)研究中仍以骨髓來(lái)源的DC較為多見(jiàn)。課題組前期培養(yǎng)脾臟來(lái)源DC純度低[7]，方法經(jīng)改良后純度明顯增加[18]。考慮臨床上將病人自身來(lái)源的DC進(jìn)行改造后用于自體輸注治療的嘗試，與獲取病人脾臟來(lái)源的tolDC相比，骨髓源性tolDC具有以下優(yōu)勢(shì)：(1)對(duì)患者創(chuàng)傷性更?。?2)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的要求不高、操作簡(jiǎn)單且容易獲取大量的高純度的DC；(3)安全性高；(4)患者接受可能性更高；(5)更具有向臨床上推廣的可行性。雖然運(yùn)用磁珠分選能夠獲得足夠數(shù)量的高純度的DC，但成本較高[11]。因此本實(shí)驗(yàn)著眼于利用DC前體細(xì)胞暫時(shí)貼壁特性來(lái)分離獲取SD大鼠骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞，并用 NF-κB ODN Decoy誘導(dǎo)培養(yǎng)為tolDCs。

細(xì)胞因子(GM-CSF和IL-4)在單個(gè)核細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為DC的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[19-20]。GM-CSF是培養(yǎng)DC誘導(dǎo)其分化的根本，在誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中單個(gè)核細(xì)胞定向轉(zhuǎn)化為DC過(guò)程中起重要作用[21]，IL-4能夠抑制培養(yǎng)細(xì)胞群中單個(gè)核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞分化，使DC處于未成熟階段，具備處理抗原的功能，促進(jìn)DC表面共刺激分子的表達(dá)[22]。與此同時(shí)IL-4可促進(jìn)誘導(dǎo)生成DC，從而增加DC產(chǎn)量和純度[23]。成熟DC比未成熟DC更容易形成集落[10]，同時(shí)成熟DC在掃描電鏡中比未成熟DC表面有更多細(xì)且長(zhǎng)的毛發(fā)樣突起，該突起可能跟DC的抗原攝取遞呈能力有關(guān)，即細(xì)且長(zhǎng)的突起更容易將抗原呈遞給T細(xì)胞[18]。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)至第8天時(shí)，Control-DC組、Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC的鏡下形態(tài)和吉姆薩染色結(jié)果分別與文獻(xiàn)中描述的成熟DC、未成熟DC典型形態(tài)基本吻合，表明NF-κB ODN Decoy誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC呈未成熟狀態(tài)。研究表明LPS可刺激DC成熟，細(xì)胞培養(yǎng)到第7天，此時(shí)的細(xì)胞基本被誘導(dǎo)為DC，LPS作為一種刺激劑，刺激細(xì)胞后可促進(jìn)其成熟，本實(shí)驗(yàn)為了觀察用NF-κB ODN Decoy處理的Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC耐受狀態(tài)是否穩(wěn)定，故在細(xì)胞培養(yǎng)的第7天加LPS進(jìn)行短期刺激，第8天觀察可見(jiàn)LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC形態(tài)未發(fā)生顯著改變，表明NF-κB ODN Decoy誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC對(duì)LPS刺激表現(xiàn)了一定穩(wěn)定性。

細(xì)胞活性測(cè)定是至關(guān)重要的，決定培養(yǎng)的細(xì)胞能否進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。臺(tái)盼藍(lán)一直是染色死細(xì)胞以測(cè)定細(xì)胞活力的金標(biāo)準(zhǔn)[24]。這種染料被膜完整的活細(xì)胞排除在外，但可以進(jìn)入并集中在膜受損的死細(xì)胞中，使細(xì)胞呈深藍(lán)色[24]。從臺(tái)盼藍(lán)染色情況來(lái)看，Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC提取當(dāng)天和培養(yǎng)第8天細(xì)胞活力均>95%，說(shuō)明NF-κB ODN Decoy不影響DC活力，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求。此結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果類(lèi)似，表明骨髓和脾臟均可誘導(dǎo)獲得高活力的tolDCs。

本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC不僅具有DC的形態(tài)成熟和未成熟時(shí)的特點(diǎn)，同時(shí)在細(xì)胞細(xì)胞表面分子表型也符合DC及成熟度的特點(diǎn)[23]。OX-62是DC中一種相對(duì)特異性抗原，主要表達(dá)在大鼠DC表面，雖然除DC以外也有其他細(xì)胞表達(dá)，但由于其含量甚少，故目前仍把OX-62作為特異性標(biāo)志來(lái)檢驗(yàn)DC[25]。SD大鼠骨髓來(lái)源的4組DC OX-62表達(dá)均>95%且組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明骨髓可誘導(dǎo)出高純度的DC且NF-κB ODN Decoy對(duì)DC OX-62表達(dá)不產(chǎn)生影響。研究表明，DC的功能成熟與表面共刺激分子(如CD80、CD86及CD40等)有關(guān)[26]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control-DC組相比，Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC CD80、CD86陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度下調(diào)，是一種相對(duì)不成熟的細(xì)胞表型特征即耐受狀態(tài)。在細(xì)胞培養(yǎng)的第7天加LPS刺激，第8天可見(jiàn)，與LPS-DC組相比，LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC CD80、CD86陽(yáng)性率和平均熒光強(qiáng)度上調(diào)不明顯，說(shuō)明NF-κB ODN Decoy誘導(dǎo)培養(yǎng)的SD大鼠骨髓DC具有一定的穩(wěn)定性。此外，與Control-DC組相比，Decoy-DC組SD大鼠骨髓DCOD490降低，表明Decoy-DC組tolDC致淋巴細(xì)胞增殖程度降低，LPS作用后OD490略有升高，表明LPS-Decoy-DC組SD大鼠骨髓DC致淋巴細(xì)胞增殖程度不顯著，表明NF-κB ODN Decoy誘導(dǎo)培養(yǎng)的SD大鼠骨髓DC具有一定的致耐受性。

綜上所述，本研究表明利用NF-κB ODN Decoy誘導(dǎo)培養(yǎng)可獲得大量SD大鼠骨髓源性的高純度、高活力、形態(tài)及表型均表現(xiàn)耐受特性的穩(wěn)定的tolDC，確保實(shí)驗(yàn)的可行性，可為后續(xù)進(jìn)一步研究tolDC的功能特性奠定堅(jiān)實(shí)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及為免疫耐受方面的研究提供提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和細(xì)胞材料。