楊云洪， 尹朝暉， 張汝一， 顏登國， 徐偉， 趙洋， 李國勝

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肛腸外科， 貴州 貴陽 550001)

腫瘤的發(fā)生與異常的細(xì)胞增殖、分化以及凋亡密切相關(guān)，而細(xì)胞周期阻滯是導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制的主要原因之一[1-2]，因此當(dāng)前腫瘤研究的熱點主要與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)周期蛋白的研究有關(guān)。三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)作為中藥砒霜的主要成分，在多種實體瘤的治療中得到應(yīng)用，并取得了良好的效果[3-4]。ATO可以通過多種機制發(fā)揮抗腫瘤作用，有研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)可以阻滯細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，是ATO發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制之一[5-6]。小腸癌是一種少見的消化道惡性腫瘤，可供研究臨床資料較少，目前國內(nèi)外未見與ATO抑制小腸癌細(xì)胞增殖及其機制的研究報道，因此本實驗將ATO與人小腸癌HIC細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察ATO對小腸癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，研究ATO在體外的抗腫瘤作用及機制，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株及主要試劑 0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國HyClone公司，人小腸癌HIC細(xì)胞株由美國ATCC細(xì)胞庫提供；兔多克隆抗體糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)及骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc)均購自美國Santa Cruz Biotechnology Inc公司，辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP) 標(biāo)記的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購于康成生物技術(shù)公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗單抗購自Santa Cruz Biotechnology Inc公司，顯影液、定影液購于美國柯達(dá)公司，聚乙烯二氟(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜、ECL-Plus 發(fā)光試劑及高效顯影膠片均購于美國Amersham 公司。

1.1.2主要儀器 倒置顯微鏡購于日本尼康公司，BIO-RAD Power-pac 3000電泳儀購于美國 BIO-RAD公司，xCELLigence RTCA DP實時無標(biāo)記細(xì)胞分析儀和E-Plate 16檢測板均由杭州艾森生物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的人小腸癌HIC細(xì)胞， RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%雙抗)，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)液，取對數(shù)期生長的細(xì)胞用于本研究。

1.2.2ATO對人小腸癌HIC細(xì)胞增殖情況 取生長狀態(tài)良好的處于對數(shù)期的人小腸癌HIC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105/mL，50 μL培養(yǎng)基加入E-Plate 16檢測板,同時檢測其背景阻抗值；將調(diào)整好的100 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞量為5～10×103/孔)加入到E-Plate 16檢測板孔中，放置入RTCA儀，在37 ℃恒溫5%CO2的條件下培養(yǎng)孵育24 h后，將10、15、20、40及60 μmol/L ATO加入各孔處理后作為實驗組；同時加等量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS) ，設(shè)置為空白對照組。將檢測板再次放置入RTCA儀，監(jiān)控時長設(shè)定為120 h，時間間隔設(shè)定為30 min，監(jiān)測記錄細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)值，通過繪制的RTCA 系統(tǒng)動力學(xué)變化反應(yīng)曲線，觀察檢測板孔中人小腸癌HIC細(xì)胞的生長狀況。

1.2.3人小腸癌HIC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、GSK-3β、cyclin B1、c-Myc的表達(dá) 取處于對數(shù)期的人小腸癌HIC細(xì)胞，在5%CO2的37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)人小腸癌HIC細(xì)胞株2 d后，將10、15、20及40 μmol/L ATO加入培養(yǎng)皿中處理作為實驗組，另設(shè)空白對照組加等量PBS，5%CO2的37 ℃恒溫繼續(xù)培養(yǎng)2 d，收集各組細(xì)胞。將各組細(xì)胞裂解后，按常規(guī)方法提取細(xì)胞蛋白，通過BCA法測定各組蛋白濃度。取上述各組蛋白50 μg，適量蛋白加樣緩沖液稀釋后，95 ℃加熱變性10 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓100 V；經(jīng)半干式電轉(zhuǎn)儀(80 V穩(wěn)壓、4 ℃及2 h)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，置于含5%脫脂奶粉的Tris鹽酸吐溫緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)溶液，閉光室溫封閉2 h。TBST洗滌后，將膜置于一抗稀釋液(兔多克隆抗體GSK-3β、cyclin B1、cyclin D1及c-Myc按照1 ∶500稀釋)，4 ℃過夜孵育，置于二抗稀釋液(HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗按照1 ∶5 000稀釋)，室溫振搖孵育2 h，TBST洗滌3遍，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，ECL發(fā)光液A液和B液等體積混合液處理后，置于暗盒中進(jìn)行曝光、顯影和定影，各組的條帶灰度值通過數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ATO影響人小腸癌HIC細(xì)胞的增殖

通過RTCA系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測，其結(jié)果顯示，實驗組經(jīng)過10、15、20、40及60 μmol/L ATO處理后的人小腸癌HIC細(xì)胞CI值均較空白對照組明顯下降，其下降趨勢隨著ATO濃度的增加更明顯。見圖1。

圖1 連續(xù)監(jiān)測不同濃度ATO對人小腸癌HIC細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Real-time monitoring of cell proliferation of human small bowel cancer HIC by different ATO concentrations

2.2 人小腸癌HIC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、cyclin B1、GSK-3β及c-Myc的表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，10、15、20及40 μmol/L ATO組人小腸癌HIC細(xì)胞GSK-3β、cyclin B1、cyclin D1及c-Myc等相關(guān)周期蛋白的表達(dá)水平均較空白對照組均下降(P<0.05)，且隨著ATO濃度的增高，周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平越低。見圖2。

注:A為蛋白電泳圖，B、C、D及E分別GSK-3β、cyclin B1、cyclin D1及c-Myc的定量表達(dá)；(1)與空白對照組比較，P<0.05。圖2 不同濃度ATO影響人小腸癌HIC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of HIC cell cycle-related proteins of colorectal cancer affected by different concentrations ATO

3 討論

ATO可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的分化、抑制腫瘤新生血管的形成及下調(diào)端粒酶活性等多種途徑抑制腫瘤的生長[7-8]。有研究報道[9]，ATO可通過降低非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞端粒酶的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤生長。Tan等[10]在大鼠肝細(xì)胞癌模型中發(fā)現(xiàn)，ATO可以明顯降低腫瘤組織中微血管密度，抑制新生腫瘤血管形成。在本研究中，通過RTCA系統(tǒng)監(jiān)測經(jīng)不同濃度的ATO處理后的人小腸癌HIC細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示ATO可以明顯抑制人小腸癌HIC細(xì)胞的增殖，表明抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是ATO抑制小腸癌細(xì)胞生長的重要途經(jīng)。

細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控是腫瘤細(xì)胞異常增殖的主要原因，因此抑制腫瘤細(xì)胞增殖可以通過阻滯細(xì)胞周期實現(xiàn)[11]。細(xì)胞周期分為分裂期(M期)和分裂間期，分裂間期又分為DNA合成期(S期)、DNA合成前期(G1期)及DNA合成后期(G2期)[12-13]。Park等[14]研究發(fā)現(xiàn)，ATO可以阻滯腫瘤細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，細(xì)胞周期停滯于G1期，S期細(xì)胞減少，G2/M期細(xì)胞增加，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Shao等[15]研究同樣證實，ATO可以使MKN 45 細(xì)胞停滯于G2/M期，G2/M期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞減少。細(xì)胞周期的變化是一個復(fù)雜的過程，受細(xì)胞周期蛋白(cyclin )、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(cyclin dependentki-naseinhibitor， CDKI)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK三類物質(zhì)嚴(yán)格的調(diào)控[16-17]，G1/S、G2/M是該調(diào)控過程中主要的關(guān)鍵性限制點[18]。

cyclin D1是目前研究最深入的cyclinD亞型，是控制細(xì)胞由G1進(jìn)入S期的關(guān)鍵蛋白，cyclin D1的持續(xù)高表達(dá)或異常表達(dá)，導(dǎo)致G1期縮短及細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，使腫瘤細(xì)胞異常增殖[19-20]。曹琦等[21]證實，cyclin D1的作用是使Rb蛋白磷酸化，后者與轉(zhuǎn)錄因子E2F解離后，使細(xì)胞進(jìn)入S期，而ATO可以下調(diào)cyclin D1的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞停滯于G1期，抑制腫瘤的生長。潘洪濤等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，ATO可以通過下調(diào)cyclin D1，阻滯細(xì)胞周期，抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤的生長。在本研究中，經(jīng)不同濃度ATO處理后的人小腸癌HIC細(xì)胞，通過Western blot檢測cyclin D1的表達(dá)，結(jié)果顯示相對于空白對照組，ATO可以明顯下調(diào)人小腸癌HIC細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)，從而抑制人小腸癌HIC細(xì)胞增殖。cyclin B1是調(diào)控G2/M期的重要蛋白，與CDK1結(jié)合后形成有絲分裂促進(jìn)分子(mitosis promoting factor，MPF)，驅(qū)動細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期[23]。已有研究證實[24]，cyclin B1與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在許多腫瘤組織中異常高表達(dá)，如乳腺癌、胰腺癌及卵巢癌等。Park等[14]等報道，ATO可通過下調(diào)腫瘤組織cyclin B1的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞停滯在G2/M期，進(jìn)而抑制腫瘤增殖。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ATO處理后的人小腸癌HIC細(xì)胞cyclin B1表達(dá)明顯下降，表明ATO可以下調(diào)人小腸癌HIC細(xì)胞中cyclin D1的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤增殖。GSK-3β是細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要成分，可通過結(jié)合降解β-catenin從而影響調(diào)節(jié)Wnt 信號通路[25-26]。有研究發(fā)現(xiàn)[27]，GSK-3β可以直接抑制β-catenin對cyclin D1的降解，促使腫瘤細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，下調(diào)GSK-3β的表達(dá)可以抑制腫瘤的生長。本研究將ATO與人小腸癌HIC細(xì)胞培養(yǎng)后，檢測結(jié)果顯示GSK-3β表達(dá)明顯下降，表明ATO可以下調(diào)人小腸癌HIC細(xì)胞中GSK-3β的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤增殖。c-Myc是一種核內(nèi)磷酸化蛋白，在乳腺癌、結(jié)腸癌及宮頸癌等惡性腫瘤組織中高表達(dá)，c-Myc可以上調(diào)cyclin D和CDK的表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞的G1/S轉(zhuǎn)換[28-29]。Chen等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在體外敲除腫瘤細(xì)胞中c-Myc基因，使細(xì)胞周期停滯，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在本研究中，ATO處理人小腸癌HIC細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)人小腸癌HIC細(xì)胞C-myc均不表達(dá)，表明ATO可以通過下調(diào)c-Myc的表達(dá)，抑制人小腸癌HIC細(xì)胞增殖。

綜上所述，ATO可以在體外抑制人小腸癌HIC細(xì)胞的增殖，同時明顯下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、cyclin B1、GSK-3β及c-Myc的表達(dá)，可能是ATO抑制人細(xì)胞增殖的重要機制之一。本研究在細(xì)胞及蛋白水平上初步探討了ATO對體外人小腸癌HIC細(xì)胞的作用及其可能的機制，但沒有進(jìn)行動物體內(nèi)實驗，因此下一步打算進(jìn)行動物體內(nèi)實驗，在基因水平上探究其機制及可能的信號通路。