何盛梅， 李昌亞， 孟令輝， 趙厚育

(貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科， 貴州 貴陽 550004)

喉癌是一種發(fā)生于頭頸部的常見腫瘤，由于發(fā)病位置特殊，可影響患者發(fā)音、呼吸和吞咽功能，因此嚴重影響患者的生活質(zhì)量[1]。除了手術(shù)治療，大部分喉癌需要結(jié)合化療，其中順鉑是喉癌等頭頸部鱗癌的一線化療用藥，具有便宜、高效等特點[2]。然而，喉癌細胞對順鉑(cisplatin，DDP)的敏感性下降，直接影響治療效果，但目前癌細胞對DDP耐藥機制尚不清楚[3]。凋亡是化療藥物誘導腫瘤細胞死亡的主要模式，凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)家族在調(diào)節(jié)腫瘤細胞的凋亡敏感性方面起著核心作用[4]。Livin是IAP家族新成員，具有強大的抗凋亡能力，特異性表達于人的胚胎組織及許多腫瘤組織中，在正常成人組織中低表達或無表達，是當今腫瘤治療的一個新靶點[5]。課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，Livin在喉癌中高表達且和不良預(yù)后相關(guān)[6]，因此本研究通過RNAi沉默Livin的表達而獲得喉癌細胞對DDP的敏感度提升，可能為喉癌增敏治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與主要試劑 人喉鱗癌Hep2細胞株購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫； RPMI-1640培養(yǎng)基和Trizol RNA提取試劑(美國Gibco)，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen)，小鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology)，鼠抗人Livin單克隆抗體(美國Chemicon)，兔抗人Caspase 3多克隆抗體(武漢博士德)，噻唑藍[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide，MTT；美國Sigma]，洗滌緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)和磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)由實驗室配制， DDP購自山東齊魯制藥廠。

1.1.2主要儀器 臺式低溫高速離心機(beckMAN COULTER.INC)，蛋白半干式轉(zhuǎn)膜儀(美國BioRad)，Power PAC-300電泳儀(美國Bio-Rad)，RNA/DNA定量儀(美國Pharmacia)，凝膠成像系統(tǒng)(日本Olympus)，磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠)，恒溫干燥箱(上海醫(yī)療器械廠)。

1.2 方法

1.2.1靶向Livin的siRNA真核表達載體的構(gòu)建、細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 依據(jù)GenBank中Livin基因已知序列(NM-139317)，結(jié)合網(wǎng)上在線設(shè)計軟件，對它們的共同序列篩選出3條干擾序列，并合成3對siRNA。siRNA1：靶序列為5′ -CCGTGTCCATCGTCTTTGT-3′，正義鏈為5′ -CCGUGUCCAUCGUCUUUGU dTdT-3′，反義鏈為3′ -dTdT GGCACAGGUA GCAGAAACA -5′。siRNA2：靶序列為5′- GGAAGAGACTTTGTCCACA -3′，正義鏈為5′ -GGAAGAGACUUUGUCCACA dTdT-3′，反義鏈為3′-dTdTCCUUC UCUGAA ACAGGUGU-5′。siRNA3：靶序列為5′- AGAGAGGTCCAGTCTG AAA -3′，正義鏈為5′-AGAGAGGUCCAGUCUG AAA dTdT-3′，反義鏈為3′ -dTdTUCUCUCCAGGUCAGACU UU-5′。siRNA序列由廣州瑞博生物科技有限公司合成，所得siRNA分別命名為：Livin-siRNA1、Livin-siRNA2、Livin-siRNA3及control-siRNA。同時設(shè)計出非特異性靶序列作為陰性對照。Hep-2 細胞在含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中、37 ℃的5%CO2培養(yǎng)，細胞轉(zhuǎn)染過程按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行，以6孔培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L，用Lipofectamine 2000為轉(zhuǎn)染試劑，按說明書進行轉(zhuǎn)染。研究分為Hep2細胞+control-siRNA組(Hep2-con組)、Hep2細胞+ Lipofectamine 2000組(Hep2-L組)、Hep2細胞+Livin-siRNA1轉(zhuǎn)染組(Hep2-s1組)、Hep2細胞+Livin-siRNA2轉(zhuǎn)染組(Hep2-s2組)、Hep2細胞+Livin-siRNA3轉(zhuǎn)染組(Hep2-s3組)及Hep2細胞+PBS空白對照組(Hep2組)。根據(jù)Livin-siRNA轉(zhuǎn)染喉鱗癌Hep2細胞對Livin表達的影響結(jié)果，在后續(xù)實驗中，合成的3對siRNA僅保留干擾效果最好Hep2-s1，即后續(xù)實驗中僅有Hep2-con組、Hep2-L組、Hep2-s1組及Hep2組。

1.2.2Western blot檢測Livin蛋白表達水平 收集需要檢測蛋白的細胞并提取細胞總蛋白，取蛋白樣品各10 μL進行聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，硝酸纖維素膜浸泡于10%脫脂奶封閉液，室溫下緩慢搖動1 h，加鼠抗人Livin單克隆抗體(1 ∶400)，4 ℃振搖孵育過夜；洗滌緩沖液(tris buffered saline tween,TBST)洗膜，加用辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液室溫下振搖孵育1 h，將PVDF膜浸于顯色液中觀察結(jié)果，用凝膠成像分析儀進行攝像。

1.2.3MTT檢測細胞活力 培養(yǎng)細胞，調(diào)整濃度為2×107個/L，細胞按100 μL (2×103個/孔)接種于96孔培養(yǎng)板，每組接種21個孔；37 ℃的5%CO2孵箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)7 d，每孔加5 g/L MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，棄上清；每孔加二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μL，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，選擇490 nm波長于酶標儀上測定各孔光吸收值(optical density，OD)，記錄結(jié)果。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞周期變化及凋亡 對數(shù)生長期Hep2細胞按5×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板，細胞貼壁生長24 h，按“1.2.1”項下分組分別進行轉(zhuǎn)染，0.25%胰蛋白酶消化各組Hep2細胞，1 000 r/min 4 ℃離心10 min，去上清，PBS洗2次，緩慢加入無水乙醇2.1 mL，使乙醇終濃度達70%以固定細胞，4 ℃過夜；加碘化丙啶(propidium Iodide，PI)染液500 μL，4 ℃避光反應(yīng)30 min；流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡，分別計算各組細胞G0/G1期、S期、G2/M期各期細胞所占的百分率，觀察是否存在亞二倍體凋亡峰，計算各組細胞凋亡率[細胞凋亡率=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%]。

1.2.5平板克隆形成實驗 對數(shù)生長期Hep2細胞按5×105個/孔濃度接種于6孔培養(yǎng)板，每組細胞分別接種5個孔，細胞貼壁生長24 h，根據(jù)分組分別進行轉(zhuǎn)染，待細胞長滿至80%～85%底面積時，每組分別加入DDP至終濃度為0.00 、0.01、0.10、1.00及10.00 mg/L進行化療；0.25%胰蛋白酶消化并用吸管吹打成單個細胞，按每皿50、100及200個細胞的梯度密度將4組細胞各劑量分別接種于培養(yǎng)皿中，以十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞分散均勻；肉眼觀察培養(yǎng)皿中克隆形成情況，倒置顯微鏡(100×)下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)，計算集落形成率[集落形成率(%)=集落數(shù)/接種細胞數(shù)×100%]；重復3次，取平均值，計算各組細胞集落抑制率[集落抑制率=(1-實驗組集落形成率/對照組集落形成率)×100%]。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 Livin-siRNA轉(zhuǎn)染喉鱗癌Hep2細胞對Livin表達的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，Hep2-s1、Hep2-s2及Hep2-s3組分別與Hep2組相比，人喉鱗癌Hep2細胞Livin蛋白的表達水平降低(P<0.05)；Hep2-con組和Hep2- L組分別與Hep2組相比，人喉鱗癌Hep2細胞Livin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：(1)與Hep2組比較，P<0.05。圖1 各組細胞中 Livin蛋白的表達Fig.1 Expression levels of Livin protein in the cells of each group

2.2 Livin-siRNA轉(zhuǎn)染喉鱗癌Hep2細胞對其生長抑制及凋亡的作用

細胞生長曲線顯示，與Hep2組相比，Hep2-s1組人喉鱗癌Hep2細胞生長曲線上升平緩，各檢測點光OD下降(P<0.05)；Hep2-con組、Hep2- L組分別與Hep2組比較，各檢測點光OD基本一致 (P>0.05)，說明Livin-siRNA可抑制Hep2細胞的生長。見圖2。

注：(1)與Hep2組比較，P<0.05。圖2 各組細胞的生長曲線Fig.2 Proliferation curves of the cells in each group

2.3 細胞周期和凋亡

細胞周期結(jié)果顯示，與Hep2組相比，Hep2-s1組人喉鱗癌Hep2細胞被阻滯于G0/G1期(P<0.05)，S期細胞及G2/M期細胞明顯減少(P<0.05)，并在G1期前出現(xiàn)一明顯的亞二倍體凋亡峰，但Hep2-con組和Hep2- L組細胞周期無變化(P>0.05)；細胞凋亡結(jié)果顯示，與Hep2組相比，Hep2-s1組人喉鱗癌Hep2細胞凋亡率升高(P<0.05)，Hep2-con組和Hep2- L組分別與Hep2組比較、細胞凋亡率無變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組細胞的細胞周期和細胞凋亡率比較Tab.1 Comparison of cell cycle and apoptosis rate in the cells of each

2.4 Livin-siRNA轉(zhuǎn)染喉鱗癌Hep2細胞對其化療敏感性的影響

2.4.1平板克隆形成實驗 結(jié)果顯示，不同濃度DDP處理的Hep2-s1組與Hep2組比較， Hep2細胞克隆形成率均降低，尤以0.10、1.00和10.00 mg/L的DDP下降明顯(P<0.05)；不同濃度DDP處理的Hep2-con組、Hep2-L組分別與Hep2組比較， Hep2細胞克隆形成率無變化(P>0.05)。見圖3。

注：(1)與同濃度Hep2組比較，P<0.05。圖3 各組細胞各化療劑量下的細胞克隆形成率Fig.3 Colony formation rates of each group at different chemotherapy doses

2.4.2MTT檢測 在同一DDP藥物濃度下，Hep2-s1組與Hep2組相比，Hep2細胞存活率降低(P<0.05)；Hep2-con組、Hep2- L組分別與Hep2組比較，細胞存活率無差異(P>0.05)。見圖4。

注：(1)與同濃度Hep2組比較，P<0.05。圖4 不同濃度DDP作用后各組細胞的存活率Fig.4 Cell viability rates of each group after different concentrations DDP treatment

2.4.3DDP作用后細胞生長抑制情況 5 mg/L DDP作用后各組Hep2細胞生長抑制率均隨時間延長呈升高趨勢，Hep2-s1組與 Hep2組比較，各時間點細胞生長抑制率明顯增加(P<0.05)；Hep2-con組、Hep2- L組分別與Hep2組比較，各時間點人喉鱗癌Hep2細胞凋亡率和生長抑制率均無差異(P>0.05)。見圖5。

注：(1)與同時點Hep2組比較，P<0.05。圖5 DDP作用后不同時間點各組細胞生長抑制率Fig.5 Cell growth inhibition rates of each group at different time points after DDP treatment

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，通過RNA干擾方法沉默Livin在喉癌中的表達，獲得良好效果，觀察到喉癌細胞中Livin蛋白表達顯著減少。IAP家族中的一個重要成員Livin，在成人的正常組織中幾乎無表達，但在多種常見惡性腫瘤中高表達，如有研究發(fā)現(xiàn)Livin在腮腺腫瘤[7]、骨肉瘤[8]、卵巢癌[9]中高表達，且和不良預(yù)后有關(guān)。由于Livin有強大的凋亡抑制能力和腫瘤組織內(nèi)特異性分布，并且是影響細胞周期和細胞凋亡的關(guān)鍵分子和維持腫瘤細胞存活的必要條件[10]，因此以Livin為目的基因的腫瘤基因治療可以有效地殺死腫瘤細胞，逆轉(zhuǎn)腫瘤的惡性表型，并且能最大限度地減少對正常細胞的毒性作用[11-13]。因此以Livin基因作為腫瘤基因治療的靶點是很好的基因治療策略，本實驗利用RNA干擾技術(shù)沉默其表達，以對其功能進行進一步研究。

Livin基因作為IAP家族中的一個重要成員，不僅有強大的抗細胞凋亡作用，還可以調(diào)節(jié)細胞周期分布、抑制細胞增殖[10]。本研究探討了Livin基因?qū)毎蛲龊图毎芷诘挠绊懀魇郊毎麅x檢測結(jié)果顯示，Livin表達下調(diào)后，G0/G1期細胞增加，S期細胞及G2/M期細胞減少，提示細胞增殖能力下降，細胞增長趨勢受到抑制；通過MTT比色法繪制細胞生長曲線觀察到Livin表達下調(diào)使Hep2細胞增殖受抑，細胞生長曲線低平，缺乏指數(shù)增殖特征。另外，流式細胞儀結(jié)果還顯示，Livin表達下調(diào)后，使其主要的拮抗細胞凋亡功能喪失，細胞凋亡率升高。同時，細胞周期檢測圖也顯示在G1期前出現(xiàn)一明顯的亞二倍體凋亡峰，提示Livin RNAi有誘導細胞凋亡的作用。同樣，Wang等[14]采用RNAi沉默Livin在惡性黑色素瘤細胞中的表達后，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的增殖受到抑制。

細胞凋亡存在3條通路，即死亡受體通路、線粒體通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，并最終都通過Caspases起作用[15-17]。IAP家族具有BIR結(jié)構(gòu)域能與Caspase結(jié)合,抑制后者的活性,從而抑制細胞的凋亡[18]。在IAP家族成員中，僅有Livin具有α和β亞基，每個亞基各有1個BIR序列，Livin可通過BIR結(jié)構(gòu)域與Caspase-3結(jié)合，發(fā)揮抑制細胞凋亡的功能[19]。本實驗探討了沉默Livin后，細胞對DDP敏感性的變化。靶向Livin可能通過復雜的分子機制逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐藥，如沉默結(jié)腸癌細胞中的Livin表達，可能通過調(diào)節(jié)細胞凋亡與自噬的串擾而實現(xiàn)癌細胞對5-氟尿嘧啶的增敏[20]；Livin可能介導了前列腺癌細胞對紫杉醇的耐藥，而柚皮苷可能通過降低其表達而獲得癌細胞對該化療藥的增敏[21]；在腎癌細胞中，沉默Livin表達后，不僅可以促進細胞自噬性死亡，還可以增加腎癌細胞對DDP的化療敏感性[22]。本研究通過沉默Livin在喉癌細胞中的表達，也獲得了癌細胞對DDP的增敏作用。因此，基于Livin僅在癌細胞中表達、有正常組織中不表達的特點， Livin有望成為腫瘤治療的一個重要靶點。

Livin促進腫瘤發(fā)展的機制十分復雜，目前還未了解清楚。比如，Livin在促進下咽癌發(fā)生發(fā)展過程中，可能有JNK和AKT信號通路參與[23]；乳腺癌中，Livin可能通過p38/GSK3β路徑激發(fā)上皮間質(zhì)化過程，從而增強癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[24]。除了該通路，Livin還可以通過激活NF-κB而誘導結(jié)腸癌細胞上皮間質(zhì)化進程，增強細胞轉(zhuǎn)移能力[25]。因此，Livin促進喉癌細胞DDP耐藥的分子機制也十分復雜，需要將來的研究中進一步探索。

綜上所述，以Livin為靶點的RNAi能特異性抑制Livin的表達，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。Livin可作為包括頭頸部惡性腫瘤在內(nèi)的人類多種惡性腫瘤基因治療的一個潛在靶點。