程筱涵， 白玉華， 齊靖， 邢妍， 陳紫潔， 張渝， 王瞳， 李麗靜*，鄭曉東***

(1.哈爾濱醫(yī)科大學 大慶校區(qū) 藥物化學與天然藥物化學教研室， 黑龍江 大慶 163319； 2.哈爾濱醫(yī)科大學 大慶校區(qū) 藥理教研室， 黑龍江 大慶 163319； 3.哈爾濱醫(yī)科大學 大慶校區(qū) 遺傳學與細胞生物學教研室， 黑龍江 大慶 163319)

高血壓與心肌梗死、心力衰竭、缺血性中風及出血性中風等疾病密切相關(guān)[1]，內(nèi)皮功能失調(diào)是高血壓發(fā)生的關(guān)鍵因素[2]，血管內(nèi)皮主要通過釋放一氧化氮(nitric oxide，NO)、前列環(huán)素(prostacyclin，PGs)及內(nèi)皮源性超極化因子(endothelium derived hyperpolarizing factor，EDHF)舒張血管平滑肌，參與血壓的調(diào)節(jié)[3]。肉桂醛(cinnamicaldehyde，CA)是一種醛類有機化合物，大量存在于肉桂等植物體內(nèi)，是肉桂揮發(fā)油的主要有效成分，具有氧化性，常作為食品添加劑[4]。有研究表明CA具有擴張血管及降壓的作用[5]，然而CA對大鼠腸系膜動脈的舒張作用以及機制仍未明確，因此本研究通過不同濃度CA處理大鼠分離的腸系膜動脈及其動脈中提取的原代內(nèi)皮細胞和原代平滑肌細胞，探討CA舒張大鼠腸系膜的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康5～6周齡雄性Sprague Dawley(SD)大鼠11只，體質(zhì)量180～200 g，購買于哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)實驗動物中心[合格證號SCXK(黑)20020002]，適應性飼養(yǎng)(普通飼料，不禁食、禁水)1周后，用于血管張力檢測以及原代細胞提取。實驗操作流程經(jīng)學校倫理委員會審批通過[(2012)-006]。

1.1.2主要試劑與儀器 C108631 CA(上海阿拉丁)，苯腎上腺素(phenylephrine，PE)、左旋硝精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)、吲哚美辛(indomethacin，Indo)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)及乙酰膽堿(acetylcholine，Ach；美國Sigma)，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、高糖dulbecco's modified eagle medium(DMEM，美國Hyclone)，胎牛血清(浙江天航)、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM；上海中喬新舟)，Ⅱ型膠原酶、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)、β-actin小鼠單克隆抗體、生物素標記山羊抗兔IgG(H+L)和4,6-二氨基-2-苯基吲哚(4,6-diamino-2-phenylindole，DAPI；中國碧云天)，AF0035磷酸化內(nèi)皮一氧化氮合成酶抗體(phospho-endothelial nitric oxide synthase antibody，p-eNOS；美國Affinity)，超敏electro-chemi-luminescence(ECL)化學發(fā)光液(哈爾濱新海基因)，細胞滲透性Ca2+探針(fluo 3-AM)、Hank's平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution，HBSS；美國Thermo)，α平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin antibody，α-SMA)及血小板-內(nèi)皮細胞粘附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31；美國Abcam)，克-亨氏液(krebs-hensleit's solution，Krebs；中國武漢普諾賽)，DMT 620 M微血管張力測定系統(tǒng)(丹麥Myo Technology)，激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus)，CO2細胞培養(yǎng)箱和缺氧培養(yǎng)箱(美國Thermo)，Western blot凝膠電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-rad)。

1.2 方法

1.2.1血管張力的檢測 SD大鼠5只經(jīng)水合氯醛麻醉后取腸系膜組織，體式顯微鏡下分離腸系膜動脈；腸系膜動脈制備成2～3 mm血管段置于DMT620M血管張力檢測儀，加Krebs溶液37 ℃平衡30 min，60 mmol/L KCl 預收縮血管3次，繼續(xù)平衡20 min，加1 μmol/L PE(工作濃度系課題組前期研究確定)預收縮血管[6]。待張力穩(wěn)定后，加1、10及30 μmol/L CA，或?qū)φ战M給予與CA等體積的DMSO，記錄腸系膜動脈血管張力變化。為驗證CA引起血管舒張是否依賴于內(nèi)皮以及通過何種途徑引起舒張，實驗分為對照組即未去除腸系膜動脈血管內(nèi)皮的正常動脈血管、去內(nèi)皮組(發(fā)絲刮除血管內(nèi)皮，乙酰膽堿舒張率低于10 %為內(nèi)皮去除完全)、L-NAME+Indo組(100 mmol/L L-NAME和10 μmol/L Indo孵育30 min，工作濃度系課題組前期研究確定[6])、KCl組(60 mmol/L KCl)及DTT組(3 mmol/L DTT孵育30 min)。加1 μmol/L PE預收縮血管后加CA，觀察CA舒張腸系膜動脈的情況。使用Powerlab軟件用于記錄腸系膜動脈張力數(shù)值變化。

1.2.2原代細胞的提取及培養(yǎng) SD大鼠6只(3批次，2只/次)腹腔注入肝素20 min，水合氯醛麻醉，取腸系膜組織置于4 ℃無菌的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中，顯微鏡下分離腸系膜動脈，分別進行腸系膜動脈內(nèi)皮細胞(mesenteric artery endothelium cells，MAECs)和動脈平滑肌細胞(mesenteric artery smooth muscle cells，MASMCs)的分離培養(yǎng)。MAECs系將膠原酶Ⅱ消化液注入腸系膜動脈血管管腔孵育20 min，消化液不斷沖刷腸系膜動脈血管內(nèi)壁，收集沖刷下來的MAECs置于含有ECM的離心管中；MASMCs系縱向剪開腸系膜動脈血管，去除血管內(nèi)皮和外膜后將剩余的血管剪碎，轉(zhuǎn)移到膠原酶Ⅱ溶液中消化1 h，加20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。將上述得到的細胞懸液1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，加培養(yǎng)液重懸，將所得到的原代MAECs和MASMCs置于37 ℃的5%CO2培養(yǎng)箱24 h。

1.2.3細胞免疫熒光法 取“1.2.2”項下第3代MAECs和MASMCs，分別培養(yǎng)于2個單孔板上，經(jīng)固定、細胞破膜、封閉處理，分別孵育α-SMA(1 ∶500)和CD31(1 ∶500)一抗，24 h避光孵育對應種屬的生物素標記的熒光二抗及DAPI復染細胞核；利用激光掃描共聚焦顯微鏡分別檢測MASMCs的α-SMA蛋白和MAECs的CD31蛋白表達。

1.2.4Western blot實驗 取“1.2.2”項下第5～7代MAECs設置為常氧組(21%FiO2)和缺氧組(3%FiO2)，均給予DMSO、10 μmol/L CA及30 μmol/L CA處理24 h后提取蛋白質(zhì)，使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)進行蛋白定量；處理蛋白質(zhì)經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜封閉后，孵育目的蛋白一抗p-eNOS(1 ∶500)和β-actin(1 ∶6 000)，孵育二抗，ECL化學發(fā)光檢測液檢測各目的蛋白表達量，并ImageJ軟件進行蛋白質(zhì)條帶的光密度分析。

1.2.5激光掃描共聚焦顯微鏡法 取“1.2.2”項下第5～7代MASMCs培養(yǎng)于單孔板，避光加入HBSS溶液稀釋的fluo 3-AM熒光探針40 min，HBSS洗去多余熒光染料；利用激光掃描共聚焦顯微鏡捕獲圖像、記錄初始Ca2+熒光值即0 μmol/L的DMSO和CA組，5 min后分別加DMSO及1、10及30 μmol/L CA，記錄各組細胞熒光值的變化，并使用Fluoview-FV300(Olympus)軟件進行Ca2+熒光曲線下面積的圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CA對大鼠腸系膜動脈血管張力的影響

血管張力檢測結(jié)果表明，10和30 μmol/L CA組大鼠腸系膜動脈血管張力分別明顯高于1 μmol/L CA組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，故認為CA可促進大鼠腸系膜動脈血管舒張。見圖1。

注：(1)與1 μmol/L CA組比較，P<0.001。圖1 不同濃度CA對大鼠腸系膜動脈血管張力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CA on vasodilation of rat mesenteric arteries

2.2 L-NAME+Indo、內(nèi)皮、K+及DTT對CA舒張大鼠腸系膜動脈的影響

結(jié)果顯示，L-NAME+Indo處理組大鼠腸系膜動脈1、10及30 μmol/L CA引起的血管舒張與對應濃度對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；去內(nèi)皮處理組大鼠腸系膜動脈10 μmol/L CA引起的舒張血管程度低于對照組、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，但1和30 μmol/L CA與對應濃度對照組比較、差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；KCl組大鼠腸系膜動脈的1 μmol/L CA和對照組比較、差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但10和30 μmol/L CA舒張血管程度低于對應濃度對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；DTT處理組大鼠腸系膜動脈1 μmol/L CA與對照組比較、差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但10和30 μmol/L CA引起的血管舒張程度低于對應濃度對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見圖2。

注：(1)與10 μmol/L對照組比較，P<0.001；(2)和30 μmol/L對照組比較，P<0.001。圖2 L-NAME+Indo、內(nèi)皮、KCl及DTT對CA舒張大鼠腸系膜動脈的影響Fig.2 Effects of L-NAME+Indo, endothelium, KCl, DTT on vasodilation of mesenteric arteries by CA

2.3 原代MASMCs和MAECs的細胞形態(tài)

結(jié)果顯示，MASMC呈長梭形，α-SMA蛋白主要表達于細胞質(zhì)；MAECs呈扁平梭形，CD31蛋白主要表達于細胞質(zhì)，DAPI用于標記細胞核。見圖3。

注：綠色熒光為α-SMA蛋白(MASMCs)或CD31蛋白(MAECs)，藍色熒光為DAPI。圖3 原代細胞免疫熒光鑒定結(jié)果(細胞免疫熒光染色，×200)Fig.3 Identification images of primary cells(Cellular immunofluorescence，×200)

2.4 MAECs中p-eNOS蛋白的表達

Western blot實驗結(jié)果顯示，常氧和缺氧條件下，10 和30 μmol/L CA處理組大鼠MAECs的p-eNOS蛋白表達水平分別與DMSO組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 大鼠MAECs中p-eNOS蛋白的表達Fig.4 Expression of p-eNOS protein in MACEs of rats

2.5 MASMCs中Ca2+濃度的變化

激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，1、10及30 μmol/L CA組大鼠MASMCs中Ca2+熒光曲線下面積與DMSO組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；1、10及30 μmol/L CA組大鼠MASMCs中Ca2+熒光曲線下面積分別與同組0 μmol/L CA組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠MASMCs中Ca2+濃度的變化Fig.5 Changes of Ca2+ concentration in MASMCs of each group

3 討論

CA是從自然界的肉桂皮中提取的肉桂精油中的化合物，具有抗氧化、抗微生物及抗糖尿病的特性，且被廣泛用于香水、制藥及食品加工行業(yè)[7-9]。此外，CA可通過抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡并具有抗癌作用[10-11]。有報道也表明CA可減少動脈粥樣硬化，降低心血管疾病的發(fā)生[12]，但是關(guān)于CA與高血壓的相關(guān)報道較缺乏。內(nèi)皮是影響動脈血管舒張功能的主要因素，其中內(nèi)皮細胞中的eNOS是內(nèi)皮產(chǎn)生NO的關(guān)鍵酶，L-NAME是eNOS的主要抑制劑[13]。同樣，前列環(huán)素(epoprostenol，PGI2)也是影響血管收縮的主要因素之一，其主要由血管內(nèi)皮細胞中環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)產(chǎn)生[14]。Indo是COX的抑制劑，可以抑制PGI2的產(chǎn)生，進而抑制血管舒張[15]。因此可以利用eNOS抑制劑L-NAME和COX抑制劑Indo來抑制血管內(nèi)皮活性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)在腸系膜動脈同時孵育L-NAME和Indo，加入CA后腸系膜動脈仍然為舒張狀態(tài)，、以上實驗證明CA引起血管舒張不依賴于內(nèi)皮細胞的COX途徑。為了探討低濃度CA舒張血管是否通過NO途徑，將腸系膜動脈去除血管內(nèi)皮后，10 μmol/L CA舒張血管作用受到抑制，因此認為CA在低濃度時具有內(nèi)皮依賴性。同時利用Western blot驗證MAECs中p-eNOS蛋白表達，結(jié)果顯示無論是在常氧或缺氧條件下，MAECs中p-eNOS蛋白表達水平均無變化，證明CA引起血管舒張不依賴于內(nèi)皮細胞的NO途徑。硫酸吲哚酚是一種蛋白結(jié)合的尿毒癥毒素，可以抑制大鼠腸系膜動脈的NO信號轉(zhuǎn)導，但是可以通過EDHF途徑舒張腸系膜動脈[17]，提高細胞外K+濃度可以抑制K+通道活性從而抑制超極化[18]，本文研究證實60 mmol/L KCl可以抑制10和30 μmol/L CA引起的血管舒張。這為本文研究證明在高濃度CA不是通過內(nèi)皮途徑而是可能通過EDHF途徑提供了潛在證據(jù)。

K+和Ca2+通道是影響血管收縮功能的重要離子通道，K+通道分為4種類型，分別是大電導Ca2+激活的K+通道[large (big)-conductance calcium-activated potassium，BKCa]、對三磷酸腺苷敏感的K+通道(ATP-sensitive potassium，KATP)、內(nèi)向整流性K+通道(inwardly-rectifying potassium，Kir)及電壓依賴性K+(voltage-dependent K+，KV)通道，其中BKCa被認為是一種EDHF，其主要機制是內(nèi)皮細胞內(nèi)鈣濃度升高后，Ca2+激活的K+通道被活化，隨后引起內(nèi)皮細胞的超極化，該超極化可通過傳導方式傳到平滑肌層，進而引起血管的舒張[19]。因為血管平滑肌層的Ca2+濃度的上調(diào)是引起血管收縮的主要因素之一[20]，所以本研究在細胞水平檢測Ca2+濃度變化。首先原代細胞提取技術(shù)從腸系膜動脈血管中分離出MASMCs，并通過細胞免疫熒光實驗以及α-SMA抗體對分離出的細胞進行鑒定。結(jié)果顯示，從腸系膜動脈血管中分離出的大部分細胞表達α-SMA，證明提取分離的細胞是MASMCs。其次研究在MASMCs中孵育fluo 3-AM后，再加入1、10、30及100 μmol/L CA，通過激光共聚焦顯微鏡檢測MASMCs中Ca2+濃度的變化，利用圖像分析得到的結(jié)果表明MASMCs中Ca2+濃度幾乎沒有變化。然而本研究利用KCl溶液刺激腸系膜動脈后，再加10和30 μmol/L CA后，KCl組大鼠腸系膜動脈血管舒張程度和對照組比較明顯降低。近年來，有研究證實硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種潛在的EDHF，可以通過K+通道進而舒張血管[19]。同樣，花生四烯酸代謝物5,6-環(huán)氧二十碳三烯酸(5,6-epoxyeicosatrienoic acid，5,6-EET)通過血管舒張的內(nèi)皮源超極化因子EDHF介導的Ca2+流入來影響血管擴張[21]。以上研究為推測CA是通過EDHF途徑舒張血管提供了可行性。

DTT是一種小分子氧化還原試劑，有研究表明在放射線暴露后，DTT具有針對造血損傷和腸道損傷的保護作用[22]。H2S是常見的具有氧化性的氣體分子，且有舒張血管的作用；DTT是一種具有還原性的小分子化合物，可以抑制H2S舒張血管的作用[23]。本研究發(fā)現(xiàn)加入10和30 μmol/L的CA時，孵育DTT組大鼠血管舒張程度和對照組比較明顯受到抑制，因此提示CA舒張腸系膜動脈和還原性相關(guān)。最近有研究表明，H2S可以被過氧化氫氧化，產(chǎn)生過硫化物進而氧化激活蛋白激酶G1，最終導致血管舒張[24]。因此有理由推測CA可能是通過類似的氧化途徑舒張腸系膜動脈，但是具體機制還需要進一步的實驗證明。本文選取成年雄性SD而非雌性大鼠作為實驗研究對象，其原因是高血壓的發(fā)病具有明顯的性別特征，青年人群中男性比女性更易患高血壓，老年人群中女性的患病率則是男性的2倍，主要是由于男性和女性的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、緩激肽和NO系統(tǒng)存在差異[25]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CA可通過內(nèi)皮源性超極化因子途徑及氧化作用舒張大鼠腸系膜動脈，提示CA具有治療高血壓的潛在藥用價值。