黃 榮，王曉麗，王兆升,*，李 游，方雙杰

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100）

皺皮木瓜（Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai），多年生落葉小喬木，薔薇科木瓜屬植物，是我國(guó)南北方普遍種植的具有觀賞價(jià)值的果樹(shù)資源[1]，主要分布于山東、安徽、甘肅、重慶、云南、浙江等省[2]。其果實(shí)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)及功能成分，如碳水化合物、蛋白質(zhì)、VC、胡蘿卜素、礦物質(zhì)、多糖、酚類(lèi)化合物、黃酮、齊墩果酸、熊果酸、皂甙和有機(jī)酸等，藥食兼用。據(jù)報(bào)道，皺皮木瓜中的酚類(lèi)化合物、黃酮等具有消炎、抑菌、抗氧化和抗腫瘤的作用[3]。齊墩果酸和熊果酸具有抗腫瘤[4]、抗炎、抗高脂血癥[5]和抑制α-葡萄糖苷酶[6]的作用。鑒于皺皮木瓜較高的食用和藥用價(jià)值，其深受消費(fèi)者青睞。但皺皮木瓜存在采后極易受到微生物侵染而腐敗變質(zhì)的問(wèn)題，極大地制約了皺皮木瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

引起果實(shí)腐敗的微生物主要是細(xì)菌和真菌。腐敗微生物入侵果實(shí)主要通過(guò)代謝產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶等細(xì)胞壁降解酶來(lái)降解果實(shí)中的多糖、纖維素、半纖維素和果膠，將上述物質(zhì)分解成水和其他微生物所需的成分[7]，果實(shí)細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流出，進(jìn)而被微生物所利用，致使果實(shí)腐敗變質(zhì)。常見(jiàn)的果實(shí)腐敗微生物有歐氏桿菌（Erwinia carotovora）、芽孢桿菌（Bacillus）、灰葡萄孢菌（B.cinerea）、黑根霉（Rhizopus nigricans）、黑曲霉（Aspergillus niger）[8]、皮落青霉（Penicillium crustosum）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）、粉紅聚端孢（Trichoderma roseum）[9]、爪甲曲霉（Aspergillus unguis）[10]、青霉（Penicillium）、鐮孢霉菌（Fusarium）[11]等，種類(lèi)繁多，而且不同果實(shí)的致腐微生物種類(lèi)差別也很大。目前關(guān)于皺皮木瓜致腐微生物的研究鮮有報(bào)道，因此有必要對(duì)導(dǎo)致皺皮木瓜腐敗的微生物進(jìn)行分離鑒定，以便根據(jù)致腐微生物的特性進(jìn)行針對(duì)性抑制。

本研究以皺皮木瓜為原料，采用組織分離法對(duì)皺皮木瓜的致腐微生物進(jìn)行分離純化，觀察其菌落形態(tài)，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，旨在明確皺皮木瓜中腐敗微生物菌群，以期為皺皮木瓜貯藏過(guò)程中的腐敗控制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺皮木瓜采摘自山東省臨沂市沂州木瓜研究所，成熟度、大小相近，無(wú)病害、無(wú)機(jī)械損傷。霉菌培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、細(xì)菌培養(yǎng)采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基，酵母菌培養(yǎng)采用酵母提取物蛋白胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302） 天根生化科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒北京全式金生物技術(shù)有限公司；擴(kuò)增引物 上海華大基因有限公司；微生物培養(yǎng)基所需材料 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XFS-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1CU超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠(chǎng)；CX31生物顯微鏡 日本奧林巴斯公司；瓊脂糖凝膠電泳、PCR儀 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腐敗微生物的分離純化

挑選無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械傷、成熟度一致的果實(shí)，表面用清水清洗后立即放入二氧化氯溶液中消毒1 min，并用無(wú)菌水沖洗，晾干，將其在4 ℃恒溫環(huán)境進(jìn)行貯藏。待皺皮木瓜果實(shí)表面出現(xiàn)深褐色斑點(diǎn)時(shí)，切取健康部位和病變部位的交界處組織25 g放置于75%乙醇溶液中浸泡30 s，取出后，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3 次，然后用滅菌紗布吸干組織塊。將上述組織塊放入裝有225 mL無(wú)菌水的三角瓶中，置于恒溫水浴振蕩器中振蕩1 h，使微生物細(xì)胞充分分散均勻，制成木瓜懸浮液。將木瓜懸浮液依次稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。分別吸取不同稀釋度的木瓜懸浮液0.1 mL于PDA、NA、YPD培養(yǎng)基，涂布均勻，每個(gè)稀釋度涂布3 個(gè)平板。將PDA、YPD于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，NA于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。待培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小的不同，挑取各個(gè)平板上不同的菌落進(jìn)行劃線(xiàn)分離，直至得到純培養(yǎng)物[12]。對(duì)于PDA平板上菌落，采用點(diǎn)植法進(jìn)行進(jìn)一步純化培養(yǎng)，重復(fù)培養(yǎng)3 代。將分離得到的純菌于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 回接實(shí)驗(yàn)

將新鮮、健康的皺皮木瓜表面清洗，然后立即放入二氧化氯溶液中消毒1 min，用無(wú)菌水沖洗，晾干。于無(wú)菌操作間，用打孔器在新鮮皺皮木瓜腰部對(duì)稱(chēng)打出若干小孔。在打孔處分別接入20 μL所篩選的病原菌懸浮液，以無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照。為避免其他雜菌污染，將接種病原菌的皺皮木瓜用保鮮膜包裹。將上述木瓜放置于28 ℃恒溫環(huán)境中，觀察貯藏過(guò)程中組織變化和發(fā)病情況，根據(jù)腐敗情況最終確定該菌是否為主要致病菌[13]。從回接后腐爛的組織上再次分離純化，判斷是否與最初純化的菌種一致。

1.3.3 皺皮木瓜腐敗微生物的鑒定

1.3.3.1 細(xì)菌鑒定

將從皺皮木瓜貯藏初期分離純化后的細(xì)菌菌株在NA培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng)1～2 d后，觀察菌株的菌落形態(tài)，包括菌落大小、形狀、顏色、透明度、邊緣結(jié)構(gòu)、表面光滑度、菌落隆起形狀、表面狀態(tài)等，將觀察到的菌落形態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較，參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。同時(shí)，參照文獻(xiàn)[14]對(duì)所分離的細(xì)菌菌株的生理生化特性進(jìn)行鑒定，主要包括過(guò)氧化氫酶活性實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、葡萄糖水解實(shí)驗(yàn)、阿拉伯糖水解實(shí)驗(yàn)、木糖水解實(shí)驗(yàn)、甘露醇水解實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、NaCl耐受性實(shí)驗(yàn)等。

挑取細(xì)菌平板上的單菌落，接種于N B 培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h。取2 mL菌液10 000×g離心1 min后棄去上清液，按照天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取2 株細(xì)菌的基因組DNA。采用擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA通用引物，前引物為63F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、后引物為1387R（5’-CCCGGGATCCAAGCTTAAG-3’）擴(kuò)增目標(biāo)細(xì)菌的16S rDNA，引物由北京六合華大科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：模板DNA 3 μL，5×Buffer（含Mg2+）10 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4 μL，10 μmol/L 27 F和1492 R引物各1 μL，酶1 μL，ddH2O 30 μL。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃修復(fù)延伸5 min，4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶，確定有無(wú)目的性條帶出現(xiàn)。然后將PCR產(chǎn)物寄往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，PCR產(chǎn)物用PCR引物直接測(cè)序。測(cè)序完成后，將得到的序列在NCBI的GenBank中進(jìn)行BLAST分析，并進(jìn)行多序列比對(duì)分析，選取序列相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因序列，使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3.2 霉菌鑒定

將分離純化后的霉菌菌株接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7 d，制備顯微鏡載玻片。觀察并記錄菌落形態(tài)，包括菌落形狀、大小、生長(zhǎng)速度、菌落正反面顏色、菌絲顏色及形狀、可溶性色素、滲出物的顏色等，參考文獻(xiàn)[15-16]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

將霉菌接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)6～7 d，從培養(yǎng)基上刮取新鮮菌絲，采用CTAB法進(jìn)行霉菌總DNA的提取。霉菌采用真菌ITS通用引物（ITS1：5’-T C C G TA G G T G A A C C T G C G G-3’和I T S 4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）擴(kuò)增ITS區(qū)的rDNA序列。反應(yīng)體系50 μL（2×PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L引物ITS1和ITS4各2.0 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足50 μL）。PCR程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶，確定有無(wú)目的性條帶出現(xiàn)。然后將PCR產(chǎn)物寄往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序完成后，將得到的序列在NCBI的GenBank中進(jìn)行BLAST分析，并進(jìn)行多序列比對(duì)分析，選取序列相似性較高的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因序列，使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從腐敗的皺皮木瓜中初步分離純化出2 株細(xì)菌、6 株霉菌，沒(méi)有分離出酵母菌。將分離出的菌株編號(hào)，分別為細(xì)菌（細(xì)菌X1、細(xì)菌X2）和霉菌（霉菌M1、霉菌M2、霉菌M3、霉菌M4、霉菌M5、霉菌M6），并將這8 株菌種回接到新鮮、健康并經(jīng)過(guò)清洗消毒的皺皮木瓜表面，結(jié)果如圖1所示。

圖1 皺皮木瓜病原菌回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Back inoculation of pathogenic microbes from C.speciosa

由圖1可以看出，細(xì)菌X1和X2回接到健康的皺皮木瓜表皮后，表面出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)。斑點(diǎn)最初為淺褐色，后期變?yōu)樯詈稚?，并逐漸向四周擴(kuò)展，皺皮木瓜變軟。霉菌M1回接到皺皮木瓜表皮后，接種部位長(zhǎng)出白色菌絲，病健交界部位為淺黃色，出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象，有很強(qiáng)的霉味。霉菌M2回接到皺皮木瓜表皮后發(fā)病，初期出現(xiàn)淡褐色圓形斑點(diǎn)，后變成深褐色，并逐漸向外擴(kuò)展，變軟腐敗，具有腐敗的氣味。霉菌M3回接到皺皮木瓜表面后，表面先出現(xiàn)淺褐色斑點(diǎn)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸變?yōu)樯詈稚?，中心出現(xiàn)青綠色霉層。霉菌M4、霉菌M5和霉菌M6回接后，針刺部位失水變硬，出現(xiàn)褐色，并沒(méi)有表現(xiàn)出霉變現(xiàn)象。將回接后皺皮木瓜腐敗的部位重新進(jìn)行微生物的分離，分離純化后的菌株均與所接種菌株一致。由此可以確定，細(xì)菌X1、細(xì)菌X2和霉菌M1、霉菌M2、霉菌M3是引起皺皮木瓜腐敗的微生物。

2.2 腐敗微生物鑒定結(jié)果

2.2.1 細(xì)菌X1鑒定結(jié)果

圖2 細(xì)菌X1鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of bacterial strain X1

由圖2a可以看出，細(xì)菌X1菌落呈現(xiàn)乳白色，表面光滑、濕潤(rùn)、有光澤，呈圓形，中間凸起，不擴(kuò)展，易挑取。在光學(xué)顯微鏡下，細(xì)菌呈現(xiàn)長(zhǎng)桿狀，單個(gè)成對(duì)或呈短鏈狀排列，能形成芽孢。生理生化鑒定結(jié)果表明，細(xì)菌X1能水解淀粉，V-P實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇，對(duì)NaCl的耐受性為7%。根據(jù)X1的菌落形態(tài)及生理生化檢驗(yàn)結(jié)果，可初步確定細(xì)菌X1為芽孢桿菌屬。

通過(guò)16S rDNA通用引物擴(kuò)增細(xì)菌X1菌株的16S rDNA序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的序列上傳至NCBI基因庫(kù)中，與已登錄的該屬其他標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行多重比對(duì)分析。由圖2b可知，細(xì)菌X1與彎曲芽孢桿菌（B.flexus）遺傳距離較近，與巨大芽孢桿菌（B.megaterium）遺傳距離最近。其菌落形態(tài)和生理生化反應(yīng)結(jié)果也與B.megaterium相符，因此，可以確定細(xì)菌X1為B.megaterium。

2.2.2 細(xì)菌X2鑒定結(jié)果

圖3 細(xì)菌X2鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of bacterial strain X2

由圖3a可以看出，細(xì)菌X2菌落不規(guī)則，乳白色至奶油色不透明，表面褶皺偏濕潤(rùn)，中央扁平，邊緣呈放射狀，無(wú)暈環(huán)，桿狀，單生或短鏈狀。細(xì)菌X2的生理生化鑒定結(jié)果表明：能水解淀粉，V-P實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇，對(duì)NaCl的耐受性為7%。X2的菌落形態(tài)及生理生化檢驗(yàn)結(jié)果與芽孢桿菌屬細(xì)菌一致，可初步確定細(xì)菌X2為芽孢桿菌屬。

通過(guò)16S rDNA通用引物擴(kuò)增細(xì)菌X2菌株的16S rDNA序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的序列上傳至NCBI基因庫(kù)中，與已登錄的該屬的其他標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行BLAST分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖3b可知，細(xì)菌X2與假蕈狀芽孢桿菌（B.pseudomycoides）親緣關(guān)系最近。其菌落形態(tài)和生理生化反應(yīng)結(jié)果也與B.pseudomycoides相符，因此鑒定細(xì)菌X2為B.pseudomycoides。

Bacillus細(xì)菌也會(huì)引起其他果蔬的腐敗，嗜氣芽孢桿菌（B.aerophilus）和類(lèi)芽孢桿菌（P.agaridevorans）是腐敗楊梅的主要病原菌[17]。此外，Bacillus在腐敗的生菜[18]、胡蘿卜、黃瓜、洋蔥、西紅柿[19]等均有發(fā)現(xiàn)。

2.2.3 霉菌M1鑒定結(jié)果

圖4 霉菌M1鑒定結(jié)果Fig.4 Identification of mold strain M1

由圖4a可知，霉菌M1菌落表面具有放射狀溝紋，呈致密絨狀。菌落最初暗黃綠色，后期變?yōu)榘迭S綠色至藍(lán)綠色，質(zhì)地絲絨狀，菌絲體白色，背面呈現(xiàn)暗黃色。分生孢子不對(duì)稱(chēng)，呈扁圓形或圓形，分生孢子梗頂端有1～2 條支鏈，分生孢子梗平滑、細(xì)長(zhǎng)。由霉菌M1的菌落形態(tài)及顯微鏡觀察結(jié)果，并參照文獻(xiàn)[16]，可初步判定霉菌M1為青霉屬。

通過(guò)真菌ITS通用引物擴(kuò)增霉菌M1菌株的序列并進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的序列上傳至NCBI基因庫(kù)中，與已登錄的該屬其他標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行BLAST分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖4b所示，霉菌M1與P.crustosum的同源性最高。其菌落形態(tài)及顯微觀察結(jié)果也與P.crustosum相符，因此鑒定霉菌M1為P.crustosum。P.crustosum也會(huì)引起甜櫻桃[20]、靈武長(zhǎng)棗[21]、新疆賽買(mǎi)提杏[22]等果實(shí)的腐爛。

2.2.4 霉菌M2鑒定結(jié)果

圖5 霉菌M2鑒定結(jié)果Fig.5 Identification of mold strain M2

由圖5a可以看出，霉菌M2菌落呈灰綠色，表面粗糙，具有放射狀溝紋，背面藍(lán)黑色，菌落局限，邊緣整齊，菌絲有橫隔，分生孢子呈卵形、球形、桿狀。根據(jù)霉菌M2的形態(tài)學(xué)特征，并參照文獻(xiàn)[16]，可初步判定霉菌M2為枝孢菌屬。

以真菌ITS通用引物對(duì)霉菌M2的菌株序列擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI基因庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，下載已登錄的該屬的其他標(biāo)準(zhǔn)菌株序列，進(jìn)行BLAST比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖5b所示，霉菌M2與枝孢霉菌（Cladosporium velox）二者位于同一分支，同源性最高。其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果也與C.velox一致，因此鑒定霉菌M2為C.velox。有研究發(fā)現(xiàn)，Cladosporium也是導(dǎo)致蓮藕[23]、藍(lán)莓[24]、獼猴桃[25]腐敗的微生物。

2.2.5 霉菌M3鑒定結(jié)果

圖6 霉菌M3鑒定結(jié)果Fig.6 Identification of mold strain M3

霉菌M3的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果如圖6a所示，菌落正面呈灰綠色，細(xì)絨狀，周?chē)@以白邊，具有多道同心環(huán)紋，背面呈暗黃色，由顯微鏡觀察結(jié)果可以看出，分生孢子梗頂端呈掃帚狀，具有不對(duì)稱(chēng)小梗，分生孢子密集一簇，近球形，壁平滑。根據(jù)霉菌M3的菌落及顯微鏡觀察結(jié)果，并查閱文獻(xiàn)[16]可知，霉菌M3特征與青霉屬特征類(lèi)似。

將霉菌M3的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)得的序列上傳至NCBI基因庫(kù)中與該屬的其他標(biāo)準(zhǔn)菌株序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖6b）。霉菌M3與擴(kuò)展青霉（P.expansum）的親緣關(guān)系較近，可信度較高。結(jié)合其形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，判定霉菌M3為P.expansum。

P.expansum屬于半知菌亞門(mén)，是造成果蔬采后腐爛的主要致腐菌[26]。其致腐能力較強(qiáng)，可以局部改變pH值[27]，有利于其成功侵染果實(shí)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，P.expansum還可引起蘋(píng)果[28]、梨[29]、桃[30]等果實(shí)腐爛，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

3 結(jié) 論

皺皮木瓜果實(shí)的腐敗變質(zhì)是幾種病原菌共同作用的結(jié)果，通過(guò)形態(tài)鑒定、分子生物學(xué)鑒定，確定引起皺皮木瓜腐敗的微生物主要有B.megaterium、B.pseudomycoides、P.crustosum、C.velox、P.expansum。本研究結(jié)果可以為皺皮木瓜貯藏過(guò)程中的微生物腐敗進(jìn)程和機(jī)制提供生物學(xué)證據(jù)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)安全、綠色、高效的皺皮木瓜防腐保鮮技術(shù)提供理論支持。