李 超， 李孟芝， 崔占虎， 王 旭， 黃顯章

(1.南陽理工學院河南省張仲景方藥與免疫調節(jié)重點實驗室 河南 南陽 473000；2.福建農林大學 福建 福州 350002)

0 引言

艾葉為菊科植物艾ArtemisaargyiLevl et Vant的干燥葉[1]，其性溫，味苦、辛，歸肝、脾、腎經，具有散寒止痛、溫經止血等功效[2,3]。艾葉即可內服又可外用，以其為原料制成的艾絨是中醫(yī)臨床施灸的主要材料，效果較為顯著[4,5]。隨著對艾葉研究的深入以及禽畜飼料添加劑“禁抗”的需要，艾粉已然成為替代抗生素的理想原料中藥材。艾粉作為飼料添加劑有利于禽畜的生長發(fā)育和提高機體抗病能力，并顯著提高動物的生產性能[6-9]，其開發(fā)和使用前景廣闊。

近年來，艾產業(yè)的快速發(fā)展帶來了艾葉資源需求量的激增，其價格不斷攀升，以致艾粉摻假現(xiàn)象凸顯，嚴重影響了艾粉作為飼料添加劑的安全性和有效性。因此，簡單快捷的艾粉及其常見混偽品的鑒別方法亟待探索和建立。

到目前為止，國內外學者對艾葉的研究主要集中在化學成分、藥理作用等方面[10-14]，但對艾粉及常見混偽品的鑒別方法尚未研究，本研究結果將為艾粉的質量控制提供一種新的思路和方法，具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料

1.1 儀器與試劑

紫外-可見-近紅外分光光度計(3600 Plus，日本島津)；萬分之一分析天平(MS-TS，德國梅特勒)；超聲波清洗儀(SY- 3200 T，上海聲源)；甲醇、乙酸乙酯及石油醚(分析純，天津科密歐)；超純水(ULUP自制)。

1.2 樣品采集

艾葉樣品按照“Z”字采樣法于2018年端午前后在河南省湯陰縣伏道鎮(zhèn)周邊采集；混偽品樣品采自伏牛山樺樹盤林場，采樣方法為隨機采樣法；提取揮發(fā)油后的艾葉樣品參照水蒸氣蒸餾法完成。以上材料經南陽理工學院黃顯章副教授鑒定為菊科蒿屬植物艾(Artemisiaargyilevl et Vant)、菊科火絨草屬植物薄雪火絨草(LeontopodiumjaponicumMiq)、菊科蒿屬植物水蒿(ArtemisiaselengensisTurcz)、菊科蒿屬植物野艾蒿(ArtemisialavandulaefoliaDC)、豆科落花生屬植物落花生(ArachishypogaeaLinn) 及菊科豚草屬豚草(AmbrosiaartemisiifoliaL)。

2 方法

2.1 供試樣品的制備

將艾葉、艾桿、提油后的艾葉、薄雪火絨草、水蒿、野艾蒿、豚草、花生殼等樣品分別去雜、挑選、粉碎、混勻。制成供試樣品8類，分別為：純艾粉、艾粉+水蒿粉(1∶1)、艾粉+薄雪火絨草粉(1∶1)、艾粉+野艾蒿粉(1∶1)、艾粉+花生殼粉(1∶1)、艾粉+豚草粉(1∶1)、艾粉+提油后的艾葉粉(1∶1)、艾粉+艾桿粉(1∶1)。將上述8種供試品各稱取0.2 g(每種供試品稱取4份)，分別精密加入純水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯各20 mL，即得32份供試品溶液，超聲90 min，穩(wěn)定后過濾，濾液備用。

2.2 測試條件

紫外-可見-近紅外指紋圖譜的測定于南陽理工學院河南省方藥與免疫調節(jié)重點實驗室完成。實驗環(huán)境保持溫度在20～25 ℃，濕度在30%～40%。以純艾葉樣品為基準，以純水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯為背景進行參比，并調整基線，穩(wěn)定后進行測定，設定掃描波長為：190～1500 nm，狹縫為1.0 nm，采樣間隔為0.2 nm，測定重復試驗3次，以其均值作為檢測結果，并以其吸收峰數考察4種溶劑對艾粉及其混偽品化學成分的提取效果并進行記錄(已去除噪音背景和閾值異常的干擾波段)。預實驗結果表明，艾葉純水提取液(A)在200～1400 nm之間噪音和干擾較少，但此區(qū)域的圖譜幾乎沒有吸收峰的存在，在進一步分析其數據后，未能發(fā)掘有效信息，故后續(xù)試驗予以舍去。甲醇提取液(B)、石油醚提取液(C)、乙酸乙酯提取液(D)分別在200～1200 nm、200～800 nm及200～1400 nm的紫外-可見-近紅外圖譜中吸收峰較多，且受到干擾較小，故選用甲醇、石油醚和乙酸乙酯為提取溶劑進行下一步分析。

2.3 最佳稱樣量的確定

準確稱取純艾葉樣品0.1 g、0.2 g、0.25 g、0.5 g、1.0 g各3份，分別加入甲醇、石油醚及乙酸乙酯各20 mL，即得15份艾葉樣品試液，超聲提取時間為90 min，過濾。結果顯示，稱樣量為0.1 g透光率過大，吸收峰也不穩(wěn)定；而稱樣量為0.2 g、0.25 g、0.5 g和1.0 g時吸收峰數和吸收強度較為理想，且差異不明顯，故將最佳稱樣量設定為0.2 g。

2.4 最佳提取時間的確定

準確稱取多份0.2 g純艾葉樣品，分別加入20 mL甲醇、石油醚及乙酸乙酯，超聲提取，時間分別設為30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，提取后過濾。結果顯示，提取時間為30 min和60 min時出峰產生漂移，90 min、120 min、150 min較為穩(wěn)定且吸收峰數和吸收強度差異不明顯，故將最佳提取時間確定為90 min。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度的考察

以純艾葉樣品為研究對象，準確稱取0.2 g樣品多份，分別加入20 mL甲醇、石油醚及乙酸乙酯后，超聲提取90 min，分別制備甲醇、石油醚及乙酸乙酯的艾葉提取液，平行測定5次，計算相對標準偏差，其RSD均小于0.52%，即精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性的考察

以純艾葉樣品為研究對象，按照2.5.1節(jié)中方法制備甲醇、石油醚及乙酸乙酯的艾葉提取液，分別放置0 h、1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h、24.0 h后進行測定，計算相對標準偏差，其RSD均小于1.08%，即樣品的穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性的考察

以純艾葉樣品為研究對象，準確稱量艾葉樣品5份，按照2.5.1節(jié)中方法制備甲醇、石油醚及乙酸乙酯的艾葉提取液并進行測定，計算相對標準偏差，其RSD均小于0.83%，即重復性良好。

3 結果與分析

艾粉與7種常見混偽品(艾葉+水蒿打粉、艾葉+薄血火絨草打粉、艾葉+花生殼打粉、艾葉+野艾蒿打粉、艾葉+豚草打粉、艾葉+提油后艾葉打粉、艾葉+艾桿打粉)的甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的紫外-可見-近紅外指紋圖譜見圖1。由圖1可知，同一溶劑提取的艾粉及混偽品的紫外-可見-近紅外指紋圖譜相似度較高，不能直觀地通過圖譜中的峰位、峰強及峰數等參數對其進行區(qū)分和鑒別。

3.1 紫外-可見-近紅外指紋圖譜相似度評價

相似度評價體系是指將所提取到的相似度較高的吸收峰采用正態(tài)檢驗法進行識別，并對組內吸收峰波長極差值與該組和相鄰組的平均波長差值大小進行比較。本研究首先借助origin分析軟件(9.0，OriginLab公司)拾取特征峰值，結果顯示，甲醇提取液的特征峰有12組(524 nm、553 nm、625 nm、756 nm、760 nm、763 nm、774 nm、777 nm、782 nm、787 nm、792 nm、795 nm)，石油醚提取液的特征峰有23組(252 nm、258 nm、265 nm、300 nm、320 nm、341 nm、360 nm、363 nm、462 nm、522 nm、549 nm、556 nm、565 nm、578 nm、584 nm、587 nm、591 nm、631 nm、635 nm、639 nm、642 nm、692 nm、697 nm)，乙酸乙酯提取液的特征峰有18組(381 nm、 447 nm、521 nm、549 nm、624 nm、718 nm、725 nm、732 nm、738 nm、755 nm、763 nm、766 nm、772 nm、778 nm、781 nm、787 nm、791 nm、796 nm)。以純艾粉的均值特征峰值作為對照，將7種混偽品進行相似度對比，分析結果見表1。

表1 艾粉及混偽品的特征峰和全譜相似度評價

從表1可以看出，純艾粉與其混偽品的特征峰在3種提取液中的相似度普遍較高，甲醇提取液中的相似度均高于98.9%，石油醚提取液中的相似度均高于97.2%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于99.1%，即借助光譜特征峰的相似度評價不能有效地對純艾粉及其混偽品進行區(qū)分。鑒于上述結果，本研究嘗試采用全譜相似度評價代替共有特征峰相似度評價以探索艾粉與混偽品之間的差異，即以共有模式建立純艾粉的對照圖譜，以均值作為對照圖譜的吸收強度，分析結果亦見表1。從表1可以看出，純艾粉與其混偽品的圖譜在3種提取液中的相似度較高，甲醇提取液中的相似度均高于94.2%，石油醚提取液中的相似度均高于92.6%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于95.2%，即借助全光譜的相似度評價也不能對純艾粉及其混偽品進行區(qū)分。以上結果表明，特征峰及全光譜相似度評價體系均不能對艾粉及其混偽品進行區(qū)分和鑒別，應進一步考慮其他計量學方法挖掘潛在和有效的差異。

3.2 純艾粉及其混偽品的主成分分析

主成分分析是利用降維的方式將原始的多個變量通過線性變換轉化為新的少數綜合指標的分析方法，即從原始變量中導出少數的幾個主成分，使它們盡可能多地保留原始變量的信息，該方法具有信息損失少、相關最優(yōu)和回歸最優(yōu)等特點。

在艾粉與混偽品的光譜波段中，選取干擾小、指紋差異大的波段作為分析對象，即甲醇提取液波段350～800 nm、石油醚提取液200～700 nm及乙酸乙酯提取液波段250～800 nm，并組成相關數據矩陣，借助SPSS軟件(SPSS 19.0，USA)和SIMCA-P軟件(Simca-p 12，Sweden)進行分析，分析結果見表2。從表2中可以看出，甲醇提取液中共提取5個主成分(特征值大于1)，累計可信度為99.56%；石油醚提取液中共提取5個主成分，累計可信度為99.65%；乙酸乙酯提取液中共提取5個主成分，累計可信度為99.75%。以上較高的累計可信度，說明所提取的主成分可替代原始光譜信息進行進一步的分析和挖掘。

表2 主成分的特征值及累計可信度

圖2 艾粉及混偽品的不同溶劑提取液PCA得分圖

圖2為艾粉及其混偽品在甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的PC1/PC2散點圖，從該散點圖中可以看出，甲醇提取液的主成分分類效果欠佳，艾粉及混偽品的分布無序且分散，存在多處交叉和超越置信閾值，無法達到理想的分類效果；石油醚提取液的主成分分類效果較為理想，除艾葉+艾桿與艾葉+薄雪火絨草出現(xiàn)部分交叉外，艾粉及混偽品的分布相對獨立且集中；乙酸乙酯提取液的主成分分類效果相對最為理想，艾粉及混偽品的分布相對獨立且集中，沒有出現(xiàn)交叉混亂，象限內分布也比較均勻。因此，基于主成分分析的乙酸乙酯提取液光譜技術適用于艾粉及其混偽品的鑒別與分類，下一步將以乙酸乙酯提取液的光譜數據進行挖掘和分析。

3.3 偏最小二乘判別分析

在3.2節(jié)基礎上，將艾粉及其混偽品的乙酸乙酯提取液光譜數據代入SIMCA軟件進行PLS-DA分析。在PLS模型構建中，將艾粉及混偽品樣品數據設置為“class 1～class 8”，自動擬合后進行交叉驗證及預測因變量的變化。結果顯示，PLS模型共提取到9個主成分，其變量的累積R2Y值和Q2值分別達到98.80%和95.56%，說明該模型的擬合效果較好(見表3)。隨機選取艾粉及其混偽品樣品借助PLS模型進行預測(已移除觀測值)，結果顯示艾粉及其混偽均被正確分類。以上結果表明，乙酸乙酯提取液光譜數據結合PLS模型可以有效地對艾粉及其混偽品進行分類。

表3 基于PLS的解釋變量和預測變量

4 討論和結論

近年來，中藥指紋圖譜技術被廣泛地應用于中藥材質量評價體系，符合中藥整體觀念和模糊性特點，并能系統(tǒng)地探尋中藥成分的種類和含量分布規(guī)律，可用于中藥材的產地、部位及真?zhèn)舞b別。本研究通過紫外-可見-近紅外指紋圖譜技術依次考察了純水、甲醇、石油醚及乙酸乙酯等提取液對艾粉及其常見混偽品的提取效果，發(fā)現(xiàn)以甲醇、石油醚及乙酸乙酯為提取溶劑的光譜數據較為豐富，圖譜吸收峰多，且受到干擾小。在初步的相似度分析中，借助origin拾取特征峰值，甲醇提取液的特征峰有12組，石油醚提取液的特征峰有23組，乙酸乙酯提取液的特征峰有18組，以純艾粉的均值特征峰值作為對照，結果顯示純艾粉與其混偽品的特征峰在3種提取液中的相似度普遍較高，甲醇提取液中的相似度均高于98.9%，石油醚提取液中的相似度均高于97.2%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于99.1%，即借助光譜特征峰的相似度評價不能有效的對純艾粉及其混偽品進行分類。鑒于特征峰分析的失敗，又嘗試采用全譜相似度評價代替共有特征峰相似度評價以探索艾粉與混偽品之間的差異，分析結果表明，純艾粉與其混偽品的圖譜在3種提取液中的相似度較高，甲醇提取液中的相似度均高于94.2%，石油醚提取液中的相似度均高于92.6%，乙酸乙酯提取液中的相似度均高于95.2%，以上結果表明，特征峰及全光譜相似度評價體系均不能對艾葉及其混偽品進行區(qū)分和鑒別。在主成分分析中，通過構建艾粉及其混偽品在甲醇、石油醚及乙酸乙酯提取液的PC1/PC2散點圖，發(fā)現(xiàn)甲醇提取液的主成分分類效果欠佳，艾粉及混偽品的分布無序且分散，無法達到理想的分類效果；石油醚提取液的主成分分類效果較為理想，但是艾葉+艾桿與艾葉+薄雪火絨草出現(xiàn)部分交叉；而乙酸乙酯提取液的主成分分類效果較為理想，艾粉及混偽品的分布相對獨立且集中，說明基于主成分分析的乙酸乙酯提取液光譜數據適用于艾粉及其混偽品的鑒別與分類。在主成分分析的基礎上，構建PLS模型，自動擬合后進行交叉驗證及預測因變量的變化，結果顯示PLS模型變量的累積R2Y值和Q2值分別達到98.80%和95.56%，說明該模型的擬合效果較好，預測結果顯示艾粉及其混偽均被正確分類。以上結果表明，乙酸乙酯提取液光譜數據結合PLS模型可以有效地對艾粉及其混偽品進行分類。

綜上所述，紫外-可見-近紅外指紋圖譜技術與化學計量學方法相結合可用于艾粉及其混偽品的分類與鑒別，且此方法操作簡便，可為艾粉及其他添加劑的等同性研究提供數據基礎和有益參考。