包林珠 時燦 盧玲兒 徐行 周澤斌 任建峰李偉明 張慶華

（1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2. 上海海洋大學(xué) 中國科學(xué)技術(shù)部海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心，上海 201306；3. 密歇根州立大學(xué)漁業(yè)與野生生物系，密歇根，美國 48824）

細胞凋亡（apoptosis）是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點問題之一，對多細胞生物的胚胎發(fā)育、個體生長、造血、免疫系統(tǒng)成熟、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及抵御外界各種因素的干擾等方面都起著重要的作用。細胞凋亡不僅是一種特殊的細胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機制［1］。在動物體內(nèi)，如果細胞增殖過度，則造成癌癥；如果細胞凋亡過度，則可引起神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默癥［2］。腫瘤細胞的無限生長是腫瘤細胞凋亡受抑制的結(jié)果，因而細胞凋亡障礙同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)系［3］。MAPK信號通路由細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2），c-Jun N端激酶（JNKs）和p38組成，它們介導(dǎo)細胞內(nèi)的一系列生物學(xué)反應(yīng)，包括細胞增殖、分化及凋亡［4］。MAPK1是細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）中的成員，又稱細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2（ERK2），能夠介導(dǎo)多種因子導(dǎo)致癌細胞凋亡［5］。

TP53在許多信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮功能，從而調(diào)節(jié)生物繁殖、發(fā)育、基因組穩(wěn)定（DNA修復(fù)）、細胞衰老、凋亡及代謝變化等各種重要的生物學(xué)活性［6］。TP53是迄今為止在人類惡性腫瘤分析中最常見的腫瘤抑制基因，在近50%的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)TP53 基因的突變［7］。Berghmans等［8］在 tp53-/-突變體斑馬魚（Danio rerio）中觀察到惡性周圍神經(jīng)鞘瘤的發(fā)生。TP53在監(jiān)測、預(yù)防、消除腫瘤細胞以及抑制腫瘤抑制因子方面起著重要作用［9］。大量研究表明，TP53通過兩條途徑抑制細胞生長，即激活細胞周期阻滯和促進細胞凋亡［10］。

目前，斑馬魚作為常用的脊椎動物模型為人類疾病的認知作出了重要貢獻［11］。斑馬魚TP53與人和小鼠的TP53蛋白氨基酸序列分別具有48.3%和48.5% 的同一性，而且在5個保守區(qū)域的氨基酸序列的一致性都很高，均為75%、92.3%、100%、100%和94.1%［12］，與其他模型動物相比，斑馬魚在識別tp53基因調(diào)控的新機制方面具有許多優(yōu)勢［13］。因在斑馬魚中易于進行正向和反向遺傳操作技術(shù)和化學(xué)篩選，使其非常適合鑒定和表征脊椎動物tp53途徑相關(guān)的藥物和基因，如抗癌藥物喜樹堿和mdm2基因［14］。由于蛋白激酶代表了真正的藥物靶標，尤其是ERK1/2信號，因此受到眾多生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家的極大關(guān)注［15］。有研究報道，在人HEK293T細胞中，MAPK1可通過磷酸化活化TP53基因［16］。在兔晶狀體上皮細胞（rabbit lens epithelial cells，RLECs）中，在鈣霉素的作用下，MAPK1可以促進TP53的表達［17］。然而在斑馬魚中，mapk1基因?qū)p53基因的調(diào)控作用未有報道。由于目前在斑馬魚模型研究中缺少相應(yīng)蛋白的抗體，使得蛋白之間的調(diào)控作用存在諸多瓶頸。啟動子作為基因的“開關(guān)”，對于基因的時空表達特性起著至關(guān)重要的作用。報告基因是基因功能研究的有效方法之一，本研究旨在啟動子-基因?qū)用娼⒁粋€基因間相互作用的研究系統(tǒng)，因此我們構(gòu)建了斑馬魚mapk1基因的表達質(zhì)粒和tp53報告基因，結(jié)果表明mapk1可以促進tp53表達，明確了兩者的調(diào)控作用關(guān)系，以期為斑馬魚的細胞凋亡的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用AB品系斑馬魚購自中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所斑馬魚平臺，按照上海海洋大學(xué)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定（SHOUDW-2016-003）進行飼養(yǎng)。海洋動物組織基因組 DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞購自天根科技（北京）有限公司?？寺幼犹卣餍蛄兴靡镉缮ど锕こ蹋ㄉ虾＃┕煞萦邢薰竞铣?。擴增序列所用聚合酶、pMDTM19-T克隆載體試劑盒購自TaKaRa（北京）。報告基因構(gòu)建所用限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶購自 NEB（北京）。Dual-Luciferase?報告基因活性檢測試劑盒、Fugene?HD 轉(zhuǎn)染試劑購自Promega。配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物用簡單培養(yǎng)基 Opti-MEM 購自 Gibco Life。實驗用人胚腎細胞（human embryonal kidney，HEK293T）、pGL3-Enhancer 載體及內(nèi)參質(zhì)粒 phRL-TK 均由海軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)國家重點實驗室惠贈。斑馬魚胚胎成纖維細胞（zebrafish embryo fibroblasts cell，ZF4）由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 序列分析及引物設(shè)計 從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫獲取啟動子和氨基酸序列，使用的斑馬魚tp53啟動子序列位于斑馬魚5號染色體，位置范圍為：NC_007116.7（24085530-24087491），斑馬魚Mapk1編碼區(qū)參考序列登錄號為NP_878308.2，人（Homo spaiens）MAPK1編碼區(qū)參考序列登錄號為NP_002736.3，小鼠（Mus musculus）MAPK1編碼區(qū)參考序列登錄號為NP_0010337 52.1。用NCBI中的Primer-BLAST設(shè)計引物。用Meth primer（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）預(yù)測斑馬魚tp53啟動子區(qū)CpG島。 用 Alibaba2.0（http：//gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html）分析tp53啟動子序列中潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，并分析該啟動子區(qū)特征序列。用Snapgene軟件構(gòu)建質(zhì)粒圖譜，運用DNAMAN 軟件對比不同物種的氨基酸序列。

1.2.2 斑馬魚tp53啟動子報告基因構(gòu)建 從NCBI網(wǎng)站獲得斑馬魚tp53基因的啟動子序列，通過軟件預(yù)測啟動子序列中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，選擇含有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的2 000 bp左右進行PCR擴增，擴增程序見表1，引物為tp53-F1和tp53-R1（表2）。在擴增出來的tp53啟動子序列的最前端和最后端設(shè)計添加酶切位點的引物tp53-F2和tp53-R2，兩個限制性內(nèi)切酶分別為Kpn I-HF和Xho I，引物中酶切位點加下劃線，酶切位點之前的3個堿基為保護堿基，用于后續(xù)的報告基因構(gòu)建。用兩個限制性內(nèi)切酶分別對擴增出來的tp53啟動子序列和 pGL3-Enhancer質(zhì)粒（圖1-A）進行雙酶切。得到的兩種酶切產(chǎn)物用 T4 連接酶連接，構(gòu)成pGL3-tp53-Luc質(zhì)粒（圖1-B）。連接成功后轉(zhuǎn)化至天根的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。將轉(zhuǎn)化物涂到含有氨芐抗性的普通肉湯瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，第二天挑取單個的白色菌落擴搖菌液，通過pGL3-Enhancer通用引物，以擴搖的菌液為模板進行PCR，通過凝膠電泳檢測篩選出含有正確大小插入片段的陽性克隆，并隨機選擇5個片段大小正確的菌液進行測序，將測序結(jié)果與目的片段參考序列進行對比，將與參考序列對比完全一致的菌液保存，用于后續(xù)提取質(zhì)粒。

圖1 pGL3-Enhancer質(zhì)粒（A）與 pGL3-tp53-Luc重組質(zhì)粒（B）示意圖Fig. 1 Schematic diagram of pGL3-Enhancer plasmid（A）and pGL3-tp53-Luc recombinant plasmid（B）

表1 PCR試劑及體系Table 1 PCR reagents and systems

表2 實驗所用的引物序列Table 2 Primer sequences used in the experiment

1.2.3 斑馬魚tp53啟動子報告基因活性檢測 人胚胎腎細胞HEK293T所需的培養(yǎng)液為含有10% FBS的DMEM，將HEK293T細胞置于37℃，含有5%濃度CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，將HEK293T細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，接種細胞密度約為5.0×104個/孔。等細胞匯合度達到70%，將配置好的轉(zhuǎn)染體系（表3）在28℃中放置15 min后物添加至細胞培養(yǎng)板的1個孔中，以pRL-TK質(zhì)粒作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染后，將HEK293T細胞放在37℃含有5%濃度CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后用Promega的 Dualluciferase?Reporter Assay System進行雙重熒光素酶測定，計算 firefly luciferase 與 Renilla luciferase 的比值，每個樣品設(shè)置3 個復(fù)孔，每組實驗重復(fù)3次。

表3 檢測tp53啟動子報告基因活性的轉(zhuǎn)染體系Table 3 Transfection system for detecting tp53 promoter reporter gene activity

斑馬魚胚胎成纖維細胞ZF4所需的培養(yǎng)液為含有10% FBS的DMEF12，將ZF4細胞置于28℃，含有5% 濃度CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染體系和檢測方式與HEK293T細胞一致。

1.2.4 mapk1的CDS序列的擴增 在斑馬魚 mapk1編碼區(qū)CDS（coding sequence）序列的兩端設(shè)計引物。用Trizol提取斑馬魚總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用CDS上下游引物和高保真酶擴增目的片段。PCR擴增體系同表1，引物為表2中的mapk1-F1和mapk1-R1，擴增條件為：在98℃下預(yù)變性3 min；在98℃下變性30 s，在67℃下退火10 s，在72℃下延伸3 min，此處共進行35個循環(huán)；最后在72℃下延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，將與目的序列長度一致的條帶用天根的DNA回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化到天根的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。將轉(zhuǎn)化物涂到含有氨芐抗性的普通肉湯瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜，第2天進行藍白斑篩選。挑取白色單個菌落擴搖菌液，通過pMD19-T通用引物，以擴搖的菌液為模板進行PCR，通過凝膠電泳檢測篩選出含有正確大小插入片段的陽性克隆，并隨機選擇5個片段大小正確的菌液進行測序。測序結(jié)果與參考序列相一致的菌液提質(zhì)粒用于后續(xù)表達質(zhì)粒構(gòu)建。

1.2.5 構(gòu)建pCMV-Tag2B-mapk1表達質(zhì)粒 以上一步連接pMD19-T成功的質(zhì)粒為模板，利用加酶切位點的上下游引物mapk1-F2和mapk1-R2（表2）和高保真酶擴增含有酶切位點的目的片段，擴增條件同上。雙酶切位點為EcoR I和Xho I，引物中酶切位點加下劃線，酶切位點之前的3個堿基為保護堿基。經(jīng)電泳檢測，將擴增后條帶單一的PCR產(chǎn)物純化，純化產(chǎn)物與pCMV-Tag2B質(zhì)粒（圖2-A）分別進行雙酶切。雙酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，構(gòu)建pCMV-Tag2B-mapk1質(zhì)粒（圖2-B），轉(zhuǎn)化至 100 μL的DH5α感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)經(jīng)過熱擊冰置后，加入500 μL 無抗性的LB液體培養(yǎng)基進行復(fù)蘇。取適量復(fù)蘇后的挑單克隆搖菌，陽性克隆一部分送測序，一部分保存菌液。將測序成功的菌液提取質(zhì)粒，并進行雙酶切檢測。

圖2 pCMV-Tag2B質(zhì)粒（A）與pCMV-Tag2B-mapk1重組質(zhì)粒（B）示意圖Fig. 2 Schematic diagram of pCMV-Tag2B plasmid（A）and pCMV-Tag2B-mapk1 recombinant plasmid（B）

1.2.6 檢測mapk1對tp53作用 人胚胎腎細胞HEK293T 細胞培養(yǎng)于 10% FBS-DMEM 培養(yǎng)液中，置于5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中，每2 d 傳代 1 次。HEK293T 細胞轉(zhuǎn)染前 24 h 接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，接種的細胞密度約 5.0×104/孔，匯合率達到 70%。 將 內(nèi) 參 質(zhì) 粒 phRL-TK、pGL3-tp53-Luc、pCMV-Tag2B和pCMV-Tag2B-mapk1配制成310 ng每孔的轉(zhuǎn)染復(fù)合物（表4）。復(fù)合物混勻后于 28℃孵育 15 min，加到上述24孔細胞培養(yǎng)板中。轉(zhuǎn)染后的HEK293T 細胞放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng) 36 h 后按照 Promega Dual-Luciferase?Reporter Assay System 使用說明進行雙熒光素酶檢測，計算firefly luciferase 與 Renilla luciferase 的比值。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，每組實驗均重復(fù)3次。

表4 轉(zhuǎn)染復(fù)合物配制表Table 4 Formulation table of transfected compound

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚tp53啟動子序列分析結(jié)果

從NCBI網(wǎng)站獲得斑馬魚tp53基因的啟動子序列，具體序列信息如圖3，約2 000 bp，以轉(zhuǎn)錄起始位點為+1。經(jīng) AliBaba 2.0 軟件預(yù)測該序列包含Oct-1（TATGTAAAGC）、Sp-1（AGATCCCGCC）、c-Jun（CTGACGTCAC）、CREB（CTGACGTCAC）、CREBP1（CTGACGTCAC）、NF-kappa B1（AGGGGAATCC）和RAR-alpha1（TTGAACTTTT）等多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，均已在序列中標注出來。通過 Meth Primer軟件在該啟動子片段中沒有預(yù)測到CpG 島（圖4）。

圖3 斑馬魚tp53啟動子特征序列分析Fig. 3 Analysis of the characteristic sequence of the tp53 promoter in zebrafish

圖4 Meth primer-Design 軟件預(yù)測 tp53 基因啟動子區(qū)CpG島Fig. 4 Prediction of CpG island in tp53 promoter region by Meth Primer-Design software

2.2 成功構(gòu)建出斑馬魚tp53啟動子報告基因載體

將斑馬魚tp53啟動子片段連接到pGL3-Enhancer質(zhì)粒上，構(gòu)建出pGL3-tp53-Luc重組質(zhì)粒。pGL3-tp53-Luc重組質(zhì)粒通過雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳結(jié)果得到兩個條帶。約5.0 kb 的為pGL3-Enhancer，約2.0 kb 的為tp53啟動子片段（圖5）；隨后對陽性質(zhì)粒送測序，序列比對結(jié)果進一步驗證pGL3-tp53-Luc構(gòu)建正確。

圖5 pGL3-tp53-Luc雙酶切檢驗Fig. 5 Double enzyme restriction assay of pGL3-tp53-Luc

2.3 tp53報告基因在HEK293T和ZF4細胞中均有活性

將對照組pGL3-Enhancer和實驗組pGL3-tp53-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胚胎腎細胞HEK293T和斑馬魚胚胎成纖維細胞ZF4中。通過雙熒光素酶報告基因活性檢測，發(fā)現(xiàn)在HEK293T中，pGL3-tp53-Luc的luciferase活性是pGL3-Enhancer的17倍左右（圖6-A），在 ZF4細胞中，pGL3-tp53-Luc的 luciferase活性是pGL3-Enhancer的9倍左右（圖6-B）。表明本研究成功構(gòu)建斑馬魚tp53啟動子，并且該啟動子具有良好的表達活性。

圖6 pGL3-tp53-Luc活性Fig. 6 Activity of pGL3-tp53-Luc

2.4 成功構(gòu)建出pCMV-Tag2B-mapk1表達質(zhì)粒

將斑馬魚mapk1 CDS序列連接到pCMV-Tag2B質(zhì)粒上，構(gòu)建出pCMV-Tag2B-mapk1表達質(zhì)粒。我們運用 DNAMAN 軟件將斑馬魚Mapk1與人和小鼠的MAPK1氨基酸序列進行比較，結(jié)果顯示，斑馬魚和人的Mapk1一致性為91.33%，斑馬魚和小鼠的Mapk1一致性為90.79%（表5）。用斑馬魚cDNA作為模板，以斑馬魚mapk1 CDS序列的兩端設(shè)計引物，PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，擴增的條帶與目標條帶大小相符。mapk1 CDS序列大小為 1 110 bp（圖7-A）。把表達質(zhì)粒pCMV-Tag2B-mapk1雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳結(jié)果分別得到兩條目的條帶，4 324 bp為pCMV-Tag2B載體的條帶，1 110 bp為mapk1的CDS序列片段（圖7-B）。隨后對陽性質(zhì)粒送測序，序列比對結(jié)果進一步驗證pCMV-Tag2B-mapk1構(gòu)建正確。

表5 斑馬魚與人和小鼠mapk1基因氨基酸序列對比Table 5 Comparison of amino acid sequences of mapk1 gene between zebrafish and human and mouse

圖7 mapk1 CDS片段擴增（A）和 pCMV-Tag2B-mapk1雙酶切檢驗（B）Fig. 7 mapk1 CDS fragment amplification（A）and pCMV-Tag2B-mapk1 double enzyme restriction assay（B）

2.5 斑馬魚mapk1可促進tp53表達

將pCMV-Tag2B-mapk1和下游tp53啟動子報告基因pGL3-tp53-Luc共同轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，在24 h后進行l(wèi)uciferase驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)組的luciferase活性是對照組的3倍左右（圖8），表明表達質(zhì)粒pCMV-Tag2B-mapk1可以促進報告基因質(zhì)粒pGL3-tp53-Luc的表達。

圖8 pCMV-Tag2B-mapk1和pGL3-tp53-Luc共同轉(zhuǎn)染HEK293T 細胞后熒光素酶相對表達量Fig. 8 Relative expression of luciferase in the HEK293T cells co-transfected with pCMV-Tag2B-mapk1 and pGL3-tp53-Luc plasmids

3 討論

細胞凋亡對維護正常組織和器官的細胞恒定與生長平衡、乃至機體衰老等方面具有重要的調(diào)控作用［18］。斑馬魚與人類的基因相似度高達87%，目前，在斑馬魚基因庫中鑒定出許多與哺乳動物凋亡相關(guān)的基因家族，如tp53，caspase及其他凋亡調(diào)控基因等［19］，表明大部分凋亡通路在斑馬魚和高等脊椎動物的進化上有很高的保守性。因此，在細胞凋亡與發(fā)育研究領(lǐng)域，斑馬魚被認為是一種有效的實驗動物模型。

MAPK1在應(yīng)激條件下調(diào)節(jié)細胞凋亡的重要性已被廣泛研究［4，20-22］；在人類細胞中，MAPK1活化TP53是DNA損傷誘導(dǎo)細胞凋亡的重要機制［23］；然而斑馬魚mapk1基因?qū)p53基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用目前未知。本研究采用基因重組技術(shù)將斑馬魚 tp53基因啟動子連接到具有多克隆位點的 pGL3-Enhancer載體質(zhì)粒上，構(gòu)建能夠瞬時表達斑馬魚 tp53活性的報告基因載體質(zhì)粒pGL3-tp53-Luc，通過熒光素酶活性檢測，在HEK293T細胞和ZF4細胞中，斑馬魚tp53啟動子均表現(xiàn)出很高的活性，與對照組相比，活性分別高達17%和9%，表明pGL3-tp53-Luc質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過氨基酸序列對比，斑馬魚Mapk1蛋白氨基酸序列與人類的一致性高達91.33%，與小鼠的一致性高達90.79%，表明mapk1基因在斑馬魚、人類與小鼠中的功能是保守的。通過基因重組技術(shù)將斑馬魚mapk1基因編碼區(qū)序列連接到pCMVTag2B載體上，構(gòu)建能夠發(fā)揮mapk1基因功能的pCMV-Tag2B-mapk1表達質(zhì)粒。將pGL3-tp53-Luc與pCMV-Tag2B-mapk1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中，通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測，表明斑馬魚mapk1基因可促進tp53基因表達。

轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)細胞中的基因轉(zhuǎn)錄［24］。對斑馬魚tp53基因候選啟動子的生物信息分析得到8個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，它們分別是Oct-1、Sp1、c-Jun、CRE-BP1、CREB、NF-kappaB1和 RAR-alpha1；但是未檢測到mapk1的結(jié)合位點。研究顯示，Sp1參與了與細胞增殖、凋亡抗性和血管生成有關(guān)的基因的調(diào)控［25］，NF-kappaB1能夠調(diào)節(jié)翻譯水平上的TP53表達［26］。在哺乳動物中，c-Jun通過轉(zhuǎn)化成纖維細胞中的TP53來抑制凋亡［27］，CREB信號傳導(dǎo)在缺氧誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和軟骨細胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［28］。同時，有研究證明 c-Jun［29］與CREB［30］是mapk1的下游調(diào)控靶點。所以本研究中，mapk1有可能直接通過調(diào)控c-Jun或CREB活性來促進tp53表達，也可能通過其他基因發(fā)揮間接作用，具體調(diào)控方式有待進一步研究。

4 結(jié)論

本實驗通過生信網(wǎng)站分析，得知斑馬魚tp53基因的啟動子區(qū)無CpG島位點，包含7個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；斑馬魚與人和小鼠MAPK1氨基酸的一致性分別為91.33%和90.79%。用雙酶切法構(gòu)建了斑馬魚tp53基因的啟動子報告基因質(zhì)粒pGL3-tp53-Luc與mapk1基因的表達載體質(zhì)粒pCMV-Tag2B-mapk1。通過雙熒光素酶報告基因活性檢測，得知pGL3-tp53-Luc在HEK293T中的luciferase活性是pGL3-Enhancer的17倍左右，在 ZF4細胞中的luciferase活性是pGL3-Enhancer的9倍左右。在HEK293T細胞中過表達pCMV-Tag2B-mapk1 質(zhì)粒后pGL3-tp53-Luc的luciferase活性是對照組的3倍左右。