邊林林，劉慧瑩，杜 娟，劉 丹，劉文君，廖 群*

（1.江中藥業(yè)股份有限公司，江西南昌 330000；2.江西省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330000；3.中藥矯味（掩味）和感官評價(jià)關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330000）

松針(pine needle)是松科植物油松，又名短葉松、紅皮松。松針提取物含有豐富的活性物質(zhì)，如揮發(fā)油、多糖、胡蘿卜素、維生素C、維生素E和氨基酸等多種成分。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究表明松針提取物具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗突變及保肝等諸多方面的生理活性[1-2]。當(dāng)前對松針的研究報(bào)道主要集中于有效物質(zhì)提取、多糖的抗氧化性以及精油的作用等研究［3-5］，趙學(xué)麗等［6］研究了紅松松針揮發(fā)油中氨基酸的組分和化合物成分，17種游離氨基酸中必需氨基酸占總氨基酸含量的46%；董朱和孫海軍[2,7]等分別總結(jié)了松針的抗腫瘤及抗衰老作用機(jī)制；朱曉娟等［8］從分子水平探究了松針多糖和葛根黃酮組合對3T3-L1脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)代謝的影響，而對松針蛋白的研究，特別是針對蛋白的溶解性、乳化性及起泡性等功能性質(zhì)的研究較少。本研究以松針蛋白為原料，研究了pH、溫度和NaCl濃度對松針蛋白功能性質(zhì)的影響及松針蛋白消化情況，為今后松針蛋白在食品工業(yè)中的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松針蛋白（蛋白質(zhì)含量80%），由大興安嶺林格貝寒帶生物科技股份有限公司提供。一級大豆油（市售）；胃蛋白酶、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶，美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉、氯化鈉、鹽酸、醋酸鈉、氯化鈣、95%乙醇、98%濃硫酸、氫氧化鉀和氫氧化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MS204分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；320 pH Meter pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；LHH-500GSD綜合性藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱（上海藍(lán)豹試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FOSS8400凱氏定氮儀（Kjeltec）；T10均質(zhì)機(jī)（德國IKA）；XMTE-208電熱恒溫水浴鍋（國華企業(yè)集團(tuán)有限公司）；UV-1800紫外可見分光光度計(jì)（SHIMADZU）；ALLegra X-30臺(tái)式冷凍離心機(jī)（BECKMAN COULTER）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶解性

準(zhǔn)確稱取一定量的松針蛋白樣品，測定樣品中蛋白含量（C0），然后用純化水將松針蛋白配制成0.1%（m/v）的溶液，分別在不同溫度（20 、30 、40 、50 、60 、70 、80 、90 ）或調(diào)節(jié)至 一 定 pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和鈉離子強(qiáng)度（0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L）下磁力攪拌30 min，6 500 r/min離心20 min，取上清液，采用凱氏定氮儀測定上清液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算松針蛋白的溶解性[9]。

1.3.2 持水性

準(zhǔn)確稱取1.5 g松針蛋白于50 mL離心管中，加入40 mL純化水，渦旋振蕩5 min，分別于20 、30 、40 、50 、60 、70 、80 和90 恒溫水浴30 min，每隔10 mim振搖一次，3 500 r/min離心30 min，移除上清液，稱量離心管的質(zhì)量，計(jì)算松針蛋白的持水性[10]。

1.3.3 持油性

準(zhǔn)確稱取1.5 g松針蛋白于50 mL離心管中，加入15 mL大豆油，渦旋振蕩15 min，分別于20 、30 、40 、50 、60 、70 、80 和90恒溫水浴30 min，每隔10 min振搖一次，3 500 r/min離心30 min，移除上清液，稱量離心管的質(zhì)量，計(jì)算松針蛋白的持油性[11]。

1.3.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性

將松針蛋白用純化水配制成3%（m/v）的溶液，調(diào)節(jié)至一定pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和鈉離子強(qiáng)度（0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L）下磁力攪拌30 min，取50 mL加入15 mL大豆油，用均質(zhì)機(jī)乳化2 mi（n30 000 r/min），迅速從底部吸取50 μL與5 mL 0.1%的SDS溶液充分混合，在波長500 nm處測定其吸光值（A0），10 min后再次從底部吸取50 μL按上述步驟測定其吸光值（A1），松針蛋白的乳化活力指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）[12]。計(jì)算如下：

式中：0.33為大豆油體積分?jǐn)?shù)，V/V；C0為蛋白質(zhì)的濃度，g/mL。

1.3.5 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

將松針蛋白用純化水配制成3%（m/v）的溶液，分別調(diào)節(jié)至一定pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和 鈉 離 子 強(qiáng) 度（0.5 mol/L、1.0 mol/L、1.5 mol/L、2.0 mol/L、2.5 mol/L）下用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)2 min（30 000 r/min），記錄泡沫和液體總體積（V1），均質(zhì)前溶液體積（V0），靜置60 min，再次記錄此時(shí)泡沫體積（V60）。計(jì)算松針蛋白的起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）[13]。

1.3.6 體外消化率

松針蛋白消化率采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步法及參照HJ Chung[15]的方法加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取0.1 g松針蛋白于試管中，加入2 mL的HCI溶液，渦旋振蕩10 min后，使用1 mol/L的HCI調(diào)溶液pH為3.0，添加2.5×104U/mL胃蛋白酶，將試管置于電熱恒溫水浴鍋中37 、270 r/min條件下體外胃消化，每間隔0 min、30 min、60 min、90 min和120 min取0.1 μL樣品，然后使用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)樣品pH為7.0，滅酶。對120 min所得消化液調(diào)節(jié)pH為7.0，添加1.5×104U/mL胰蛋白酶，持續(xù)再消化30 min、60 min、90 min、120 min后滅酶取樣，于波長500 nm處測定吸光值，計(jì)算松針蛋白的消化率[14-15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 松針蛋白的溶解性

松針蛋白在不同pH、溫度和NaCI濃度下溶解性變化的考察結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，松針蛋白在pH為6時(shí)溶解性最小，當(dāng)pH小于6時(shí)，其溶解性隨著pH升高呈下降趨勢，當(dāng)pH大于6時(shí)則隨pH的增加呈上升。這是因?yàn)樗舍樀鞍椎牡入婞c(diǎn)接近6.0，此時(shí)蛋白表面所帶電荷被中和，降低了蛋白質(zhì)與水的結(jié)合能力，故而溶解性最??；當(dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白表面電荷增加，溶解性增大。

圖1 pH對松針蛋白溶解性的影響

由圖2可見，隨溫度的升高松針蛋白的溶解性呈上升趨勢，溫度為80 時(shí)達(dá)到最大值，超過80后溶解度降低可能是由于溫度的升高肽鏈?zhǔn)嬲菇Y(jié)構(gòu)發(fā)生變化，大量疏水性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面，蛋白質(zhì)發(fā)生了熱變性，蛋白質(zhì)溶解性下降［16-17］。

圖2 溫度對松針蛋白溶解性的影響

由圖3可見，松針蛋白的溶解性在NaCI濃度為1 mol/L時(shí)達(dá)到最大，隨著NaCI濃度的增大，由于鹽析作用使松針蛋白的溶解性下降。

圖3 NaCl濃度對松針蛋白溶解性的影響

2.2 松針蛋白的持水性和持油性

松針蛋白在不同溫度下持水性和持油性的考察結(jié)果如圖4所示。松針蛋白的持水性隨溫度的升高在60 達(dá)到最大值，持續(xù)升溫后持水性反而降低。這可能是由于溫度的上升有利于蛋白質(zhì)分子的解離和伸展，并且促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子和水分子的相互作用［18］；但隨著溫度的進(jìn)一步升高，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，分子內(nèi)部的非極性基團(tuán)大量暴露，削弱了蛋白質(zhì)與水之間的相互作用［19］，故而持水性反而出現(xiàn)下降趨勢。

圖4 溫度對松針蛋白持水性和持油性的影響

松針蛋白持油性隨著溫度的變化先升高后降低，這可能是由于在溫度逐步升高過程中蛋白質(zhì)分子逐漸伸展，肽鏈伸展后與加溫處理的油中小分子相互結(jié)合［20］，松針蛋白的持油性呈上升趨勢；而隨著溫度的進(jìn)一步升高，其持油性反而出現(xiàn)下降，則可能是因?yàn)闇囟壬邔?dǎo)致油的流動(dòng)性增強(qiáng)，黏度降低，蛋白質(zhì)變性，削弱了蛋白質(zhì)與油的相互作用。

2.3 松針蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性

松針蛋白在不同pH和NaCl濃度下乳化性和乳化穩(wěn)定性變化考察結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)pH為6.0時(shí)松針蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均處于最低值，這可能是松針蛋白接近等電點(diǎn)時(shí)，溶解性最?。▓D1可見），參與乳化的蛋白相對較少，乳化性及乳化穩(wěn)定性達(dá)到最低，遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度增大，參與乳化作用的蛋白質(zhì)分子就越多，從而促進(jìn)油／水界面之間薄膜的形成，且?guī)в须姾?，防止或減緩液滴絮凝和聚結(jié)，乳化性和乳化穩(wěn)定逐漸上升[21]。

圖5 pH對松針蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

圖6可見，隨NaCI濃度的增加，乳化性和乳化穩(wěn)定性呈下降趨勢，NaCI濃度為0.5 mol/L時(shí)乳化性和乳化穩(wěn)定性數(shù)值最大，這可能是松針蛋白在較低離子強(qiáng)度下溶解性較大，隨著離子強(qiáng)度的增加，乳化性及乳化穩(wěn)定性顯著降低，因?yàn)檩^低離子強(qiáng)度易于催化蛋白質(zhì)聚合，使單位面積油水界面上蛋白質(zhì)聚合物的數(shù)量增加，減低了油水界面表面張力，乳化性增加[22]。但隨著離子強(qiáng)度的增加影響了酶活，使單位面積油水界面上蛋白質(zhì)聚合物的數(shù)量減少，乳化性和乳化穩(wěn)定性降低[23]。

圖6 NaCI濃度對松針蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響

2.4 松針蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性

松針蛋白在不同pH、溫度和NaCI濃度下起泡性和起泡穩(wěn)定性變化的結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，松針蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性在接近等電點(diǎn)時(shí)數(shù)值呈下降趨勢，當(dāng)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，發(fā)泡力明顯提高。蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)具有最低的自由電荷，分子自身容易相互聚集，從而發(fā)生沉淀。通過調(diào)節(jié)pH，可以使蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)發(fā)生改變。經(jīng)酸調(diào)改性的蛋白質(zhì)大都具有較好的起泡性、泡沫穩(wěn)定性[24]。

圖7 pH對松針蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響

由圖8可知，松針蛋白的起泡性在50 時(shí)達(dá)到最高值，超過50 后呈下降趨勢，可能是因?yàn)闇囟壬咴黾恿说鞍踪|(zhì)的溶解，樣品中可溶性物質(zhì)增多導(dǎo)致。

圖8 溫度對松針蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響

由圖9可知，NaCl濃度在1.0 mol/L時(shí)起泡性和起泡穩(wěn)定性能力最強(qiáng)，隨之出現(xiàn)降低趨勢。因?yàn)镹aCl濃度能夠影響蛋白質(zhì)的溶解性、黏度、伸展和聚集，從而改變了起泡性和起泡穩(wěn)定性[25]。

圖9 NaCl濃度對松針蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性的影響

2.5 松針蛋白消化率

采用體外消化試驗(yàn)考察了松針蛋白消化情況，結(jié)果如下圖所示。由圖10可知，松針蛋白在胃蛋白酶消化階段前30 min時(shí)消化率上升較快，之后消化率上升減慢，在胰蛋白酶消化階段消化率緩慢升高，在總消化時(shí)間180 min時(shí)達(dá)到78.6%，而后再隨時(shí)間的增加呈緩慢下降趨勢，蛋白質(zhì)在體內(nèi)主要是在胃腸消化，胃蛋白酶和腸蛋白酶都為內(nèi)切酶，胃蛋白酶首先將食物中的蛋白質(zhì)分解成肽段，再由小腸中胰腺分泌的胰蛋白酶進(jìn)行消化分解。在胃液消化過程中，蛋白消化不完全，在腸內(nèi)得到進(jìn)一步消化。研究中消化率受很多因素的影響，消化率與消化時(shí)間、蛋白的性質(zhì)也有密切關(guān)系[26-28]。李倩等[29]研究發(fā)現(xiàn)加熱對乳清蛋白變性率呈正相關(guān)，消化時(shí)間越長，則變性率越大，消化率越低。本文中未對松針蛋白變性后消化率進(jìn)行研究，后續(xù)有待進(jìn)一步深入研究。

圖10 不同時(shí)間段松針蛋白消化率的變化情況

3 結(jié)論

（1）松針蛋白溶解性隨溫度升高呈上升趨勢，溫度為80 時(shí)達(dá)到最大值，持水性和持油性受溫度的影響，在60 達(dá)到最大值。說明適當(dāng)?shù)募訙乜稍黾铀舍樀鞍椎娜芙庑?、持水性和持油性?/p>

（2）不同pH條件下，松針蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)起泡性和起泡穩(wěn)定性較好，接近等電點(diǎn)數(shù)值呈下降趨勢，松針蛋白pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，相應(yīng)地溶解性也隨之增大，這說明松針蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性和溶解性受等電點(diǎn)的影響較大。

（3）松針蛋白的乳化性隨著NaCl濃度升高而降低，當(dāng)NaCl濃度≥1 mol/L時(shí)，NaCl濃度升高時(shí)，松針蛋白的溶解性、起泡性呈下降趨勢，說明NaCl濃度可以改變松針蛋白的溶解度、乳化性和起泡性。

（4）研究中消化率受很多因素的影響，消化率與消化時(shí)間、蛋白的性質(zhì)也有密切關(guān)系，后續(xù)有待進(jìn)一步深入研究。