徐 靜 張子儒 王德賀 陳一凡 劉雪露 張 鶴 黃晨軒 劉 萌 張 波 侯建庫 周榮艷 陳 輝* 邸科前

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定071001；2.保定市順平縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，保定071001；3.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，保定071001)

我國(guó)是雞蛋消費(fèi)大國(guó)，蛋類的需求使得家禽的集約化生產(chǎn)成為必然。為了提高蛋雞的生產(chǎn)性能及抗病力，過去的幾十年中，抗生素常被當(dāng)作飼料添加劑使用[1]，由于人類對(duì)抗生素會(huì)產(chǎn)生耐藥性，禁抗成為了新的發(fā)展趨勢(shì)[2]。鑒于此，研究人員致力于開發(fā)抗生素替代品，其中天然植物精油是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。大蒜精油是取自鮮大蒜的一種天然植物精油，主要成分為大蒜素，大蒜素具有良好的誘食、促生長(zhǎng)、抗菌和消炎等作用[3]，且在動(dòng)物體內(nèi)無殘留、無副作用。已有研究表明，飼糧中添加大蒜素可以提高產(chǎn)蛋雞的生產(chǎn)性能[4-5]，還可通過提高體液免疫和細(xì)胞免疫來提高機(jī)體的免疫力[6]。目前有關(guān)大蒜素或大蒜精油的研究多以肉雞為試驗(yàn)對(duì)象，且大多探究其對(duì)肉雞生長(zhǎng)、免疫及抗氧化等性能的影響，關(guān)于大蒜精油在蛋雞方面的應(yīng)用研究較少，且極少有試驗(yàn)探究大蒜精油對(duì)雞腸道形態(tài)及盲腸微生物區(qū)系的影響，而動(dòng)物機(jī)體的腸道形態(tài)、飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收、免疫系統(tǒng)發(fā)育、致病性腸道細(xì)菌的增殖等都與腸道菌群有關(guān)[7-9]。因此，本試驗(yàn)在5～9周齡蛋雞的飲水中添加不同濃度的大蒜精油，通過測(cè)定生長(zhǎng)性能、腸道組織形態(tài)及盲腸菌群等指標(biāo)，探究大蒜精油對(duì)蛋雞的影響，為實(shí)際生產(chǎn)中合理使用大蒜精油提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用200只1日齡健康狀況良好且體重相近的農(nóng)大三號(hào)節(jié)糧蛋雞，隨機(jī)分為4組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。各組試驗(yàn)雞飼喂相同的基礎(chǔ)飼糧，對(duì)照組正常飲水，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組在飲水中添加大蒜精油(大蒜精油中大蒜素含量為7.5%)，使其濃度分別為0.04、0.06和0.08 mL/L，試驗(yàn)期為56 d。基礎(chǔ)飼糧參照我國(guó)《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞只采用雙層籠養(yǎng)的方式于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行飼養(yǎng)，自由采食和飲水，試驗(yàn)期間嚴(yán)格按照農(nóng)大三號(hào)蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)控制光照。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

以重復(fù)為單位，每周末測(cè)定采食量。試驗(yàn)第1天和第56天08：00分別測(cè)定試驗(yàn)雞體重，作為初始體重和終末體重，并計(jì)算平均日采食量、平均日增重和料重比。

1.3.2 腸道組織形態(tài)測(cè)定

試驗(yàn)第56天，于每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取5只試驗(yàn)雞進(jìn)行屠宰，打開腹腔，分離出十二指腸、空腸和回腸，在每段腸道中段取3 cm左右腸道樣品，用生理鹽水把腸道內(nèi)容物沖洗干凈，放到4%甲醛溶液中常溫保存，以備制作石蠟切片。制作切片的具體操作為固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色和封固，采用正置光學(xué)顯微鏡測(cè)定絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨隱比(絨毛高度/隱窩深度)。

1.3.3 盲腸菌群測(cè)定

試驗(yàn)第56天，于每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取2只試驗(yàn)雞進(jìn)行屠宰，無菌采集盲腸內(nèi)容物放入凍存管，-80 ℃保存。采用Hiseq 2500高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)盲腸微生物16S rDNA基因全長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)序，由北京百邁克生物科技有限公司完成。測(cè)序流程為：使用德國(guó)MN公司的NucleoSpin 96 Soil(4×96)試劑盒提取樣品總細(xì)菌DNA后，根據(jù)16S rDNA全長(zhǎng)引物27F和1492R，合成帶有Barcode的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測(cè)序文庫(SMRT Bell)，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用PacBio Sequel進(jìn)行測(cè)序。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

將PacBio下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出為CCS文件(CCS序列使用Pacbio提供的smrtlink工具獲取)后，進(jìn)行如下3個(gè)步驟的操作。

1)CCS識(shí)別：使用lima v1.7.0軟件，通過Barcode對(duì)CCS進(jìn)行識(shí)別，得到的Barcode-CCS序列數(shù)據(jù)；

2)CCS長(zhǎng)度過濾：使用北京百邁克生物科技有限公司自主研發(fā)的軟件，對(duì)Barcode-CCS序列進(jìn)行過濾，得到有效序列；

3)去除嵌合體：使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到Optimization-CCS 序列。

對(duì)序列信息進(jìn)行操作分類單元(OTU)、多樣性及差異性分析。

1.4 數(shù)據(jù)整理與分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)程序?qū)υ囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行組間的多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飲水中添加大蒜精油對(duì)蛋雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，飲水中添加0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油對(duì)蛋雞的平均日采食量無顯著影響(P>0.05)；飲水中添加0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油均使蛋雞的料重比極顯著降低(P<0.01)，其中以大蒜精油濃度為0.06 mL/L時(shí)效果最好；飲水中添加0.04和0.06 mL/L大蒜精油均使蛋雞的平均日增重極顯著升高(P<0.01)，同樣是以大蒜精油濃度為0.06 mL/L時(shí)效果最好。

表2 飲水中添加大蒜精油對(duì)蛋雞生長(zhǎng)性能的影響

2.2 飲水中添加大蒜精油對(duì)蛋雞腸道組織形態(tài)的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，飲水中添加0.04 mL/L大蒜精油使蛋雞回腸絨毛高度極顯著降低(P<0.01)，蛋雞回腸隱窩深度及絨隱比無顯著變化(P>0.05)；飲水中添加0.06 mL/L大蒜精油使蛋雞回腸隱窩深度顯著降低(P<0.05)，回腸絨隱比極顯著升高(P<0.01)；飲水中添加0.04 mL/L大蒜精油使蛋雞空腸絨毛高度與絨隱比均極顯著升高(P<0.01)，回腸隱窩深度顯著下降(P<0.05)；飲水中添加0.06 mL/L大蒜精油使蛋雞空腸隱窩深度顯著下降(P<0.05)，十二指腸絨隱比顯著升高(P<0.05)；飲水中添加0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油使蛋雞十二指腸隱窩深度極顯著下降(P<0.01)，其中以大蒜精油濃度為0.06 mL/L時(shí)效果最顯著。

2.3 飲水中添加大蒜精油對(duì)蛋雞盲腸菌群的影響

2.3.1 OTU分析

圖2為根據(jù)不同分組繪制的OTU Venn圖，不同組用不同顏色表示，不同顏色圖形之間交疊部分?jǐn)?shù)字為2個(gè)組之間共有的OTU個(gè)數(shù)。由圖2可知，各組共有126個(gè)OTU；對(duì)照組特有17個(gè)OTU；與對(duì)照組相比，大蒜精油組特有11個(gè)OTU。其中，對(duì)照組特有OTU含擬桿菌門的為14個(gè)，大蒜精油組特有OTU含厚壁菌門的為7個(gè)。

2.3.2 α多樣性分析

由表4可知，飲水中添加大蒜精油對(duì)蛋雞盲腸微生物α多樣性指數(shù)無顯著影響(P>0.05)。

A、B、C、D分別為對(duì)照組以及0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油組十二指腸組織切片(40×)；E、F、G、H分別為對(duì)照組以及0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油組空腸組織切片(40×)；I、J、K、L分別為對(duì)照組以及0.04、0.06和0.08 mL/L大蒜精油組回腸組織切片(100×)。

CK：對(duì)照組 control group；C1：0.04 mL/L大蒜精油組 0.04 mL/L garlic essential oil group；C2：0.06 mL/L大蒜精油組 0.06 mL/L garlic essential oil group；C3：0.08 mL/L大蒜精油組 0.08 mL/L garlic essential oil group。下圖同 the same as below。

2.3.3 β多樣性分析

將構(gòu)建的OTU進(jìn)行主成分分析，由圖3可知，第1主成分和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為46.53%和23.46%，4組間樣品無交疊情況，各組盲腸在菌群構(gòu)成上無相似性。

2.3.4 各樣品在門、屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)分析

由圖4可知，在門水平上，試驗(yàn)雞盲腸中主要檢出擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、梭桿菌門(Fusobacteria)以及互養(yǎng)菌門(Synergistetes)等菌群，其中擬桿菌門、厚壁菌門與變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門。由圖5可知，在屬水平上，試驗(yàn)雞盲腸中主要檢出擬桿菌屬(Bacteroides)、別樣桿菌屬(Alistipes)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、副擬桿菌屬(Parabacteroides)等菌群，其中擬桿菌屬為核心優(yōu)勢(shì)菌屬。由表5可知，與對(duì)照組相比，各大蒜精油添加組擬桿菌門與厚壁菌門的相對(duì)豐度均無顯著變化(P>0.05)；飲水中添加0.08 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中變形菌門的相對(duì)豐度極顯著升高(P<0.01)。與對(duì)照組相比，飲水中添加0.04 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中擬桿菌屬的相對(duì)豐度極顯著升高(P<0.01)；飲水中添加0.06 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中別樣桿菌屬和考拉桿菌屬的相對(duì)豐度均顯著升高(P<0.05)；飲水中添加0.08 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中脫硫弧菌屬的相對(duì)豐度極顯著升高(P<0.01)。

表4 α多樣性分析結(jié)果

圖3 主成分分析散點(diǎn)圖

3 討 論

3.1 飲水中添加大蒜精油對(duì)蛋雞生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飲水中添加大蒜精油對(duì)蛋雞的平均日采食量無顯著影響，0.06 mL/L大蒜精油組與對(duì)照組相比料重比極顯著降低，平均日增重極顯著升高。Lim等[10]研究報(bào)道在蛋雞飼糧中添加大蒜素后蛋雞的采食量無顯著變化，王凡等[11]的試驗(yàn)結(jié)果表明大蒜素可增加蛋雛雞的平均日增重和降低料重比，與本試驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。大蒜精油能夠促進(jìn)禽類生長(zhǎng)，可能是因?yàn)榇笏饩椭械闹饕煞执笏馑鼐哂写碳ば?，能夠加快腸道蠕動(dòng)、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，進(jìn)而提高飼料的利用率，降低成本[12]。

Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Proteobacteria：變形菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Synergistetes：互養(yǎng)菌門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Elusimicrobia：迷蹤菌門；Others：其他；Unclassified：未分類。

Bacteroides：擬桿菌屬；Alistipes：別樣桿菌屬；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Akkermansia：艾克曼菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Megamonas：巨單胞菌屬；Fusobacterium：梭桿菌屬；Others：其他；Unclassified：未分類。

表5 蛋雞盲腸菌群在門、屬水平上的相對(duì)豐度

3.2 飲水中添加大蒜精油對(duì)蛋雞腸道組織形態(tài)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飲水中添加0.06 mL/L大蒜精油能夠明顯改善蛋雞回腸、空腸和十二指腸的組織形態(tài)。小腸結(jié)構(gòu)與功能的完整性影響著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)，其中小腸絨毛高度和隱窩深度與腸道生理相關(guān)，并且也是衡量腸道功能的重要指標(biāo)[13]。小腸絨毛的高度、粗細(xì)以及排列密度代表著該段腸道接觸食糜的多少，與食糜接觸越多，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入就越充分[14-15]。隱窩深度與腸上皮細(xì)胞的增殖率成反比，細(xì)胞成熟率上升的表觀即為隱窩深度下降，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率升高。絨隱比則是小腸功能的綜合體現(xiàn)，絨隱比增加說明小腸的消化吸收能力增強(qiáng)[16]。因此，本試驗(yàn)結(jié)果說明在蛋雞飲水中添加大蒜精油能夠提高飼糧中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用效率。

3.3 飲水中添加大蒜精油對(duì)蛋雞盲腸菌群的影響

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育與腸道微生物區(qū)系的平衡有著直接關(guān)系，當(dāng)動(dòng)物腸道受有害菌入侵時(shí)，會(huì)減少腸道菌群的多樣性，使得腸道微生態(tài)失衡，從而降低機(jī)體抵抗力，影響動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[17]。本試驗(yàn)使用Usearch軟件[18]對(duì)Tags在97%的相似度下進(jìn)行聚類獲得OTU，OTU反映腸道菌群的物種數(shù)目信息。α多樣性反映了單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，可通過Chao1、Ace、Shannon和Simpson指數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行衡量。Chao1和Ace指數(shù)表示了物種數(shù)量，Shannon和Simpson指數(shù)表示物種多樣性，當(dāng)物種豐度相同時(shí)，Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小的樣品物種多樣性越高[19]。OTU的覆蓋率(coverage)反映了測(cè)序結(jié)果是否具有代表性，其值越高，樣本中物種被測(cè)出的概率越高。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋雞盲腸菌群在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌群為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，與前人研究結(jié)果[20]一致。厚壁菌門的纖維分解菌較豐富[21]，盲腸擬桿菌門豐度較高時(shí)，纖維分解菌的數(shù)量也有所增加，因此當(dāng)擬桿菌門與厚壁菌門的豐度升高時(shí)，盲腸的發(fā)酵作用也隨之增強(qiáng)[22]。擬桿菌門在維持腸道微生態(tài)平衡中起著重要的作用，能夠改善宿主健康狀況[23]。而變形菌門則包括很多病原菌，如沙門氏菌和幽門螺桿菌等。洪偉[24]在蛋雞飼糧中添加150 mg/kg大蒜素，結(jié)果顯示大蒜素對(duì)變形菌門中大腸桿菌有顯著的抑制作用，Sarica等[25]、何云等[6]在肉雞上也得到相似的試驗(yàn)結(jié)果。本試驗(yàn)中，在蛋雞飲水中添加大蒜精油，結(jié)果發(fā)現(xiàn)厚壁菌門相對(duì)豐度增加，但擬桿菌門與厚壁菌門的相對(duì)豐度均無顯著變化，0.04、0.06 mL/L大蒜精油對(duì)蛋雞盲腸中變形菌門的相對(duì)豐度無顯著影響，0.08 mL/L大蒜精油使變形菌門的相對(duì)豐度極顯著升高，與上述前人研究結(jié)果不同。本試驗(yàn)結(jié)果說明過高濃度的大蒜精油可能增加了有害微生物對(duì)蛋雞腸道健康的危害。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋雞盲腸菌群在屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群主要為擬桿菌屬，隨后別樣桿菌屬、考拉桿菌屬和脫硫弧菌屬的相對(duì)豐度依次遞減。擬桿菌屬不僅能夠維持腸道微生態(tài)平衡，還能夠加速多糖的分解和利用[26]，促進(jìn)機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育。考拉菌屬屬于厚壁菌門，能夠在腸道內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，而短鏈脂肪酸能夠通過保護(hù)腸道黏膜屏障為腸道上皮細(xì)胞供能，具有降低動(dòng)物機(jī)體的炎癥水平以及增強(qiáng)胃腸道功能的作用[27]。腸道脫硫弧菌屬的豐度是潰瘍性結(jié)腸炎疾病的重要特征。本試驗(yàn)中，在蛋雞飲水中添加0.04 mL/L大蒜精油使盲腸中擬桿菌屬的相對(duì)豐度極顯著升高；添加0.06 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中別樣桿菌屬和考拉桿菌屬的相對(duì)豐度均極顯著升高；添加0.08 mL/L大蒜精油使蛋雞盲腸中脫硫弧菌屬的相對(duì)豐度極顯著升高。大蒜精油有較好的抗菌能力，其通過抑制細(xì)菌代謝達(dá)到抑菌和殺菌的效果[28]，高濃度的大蒜精油會(huì)損傷腸道，益于有害菌增長(zhǎng)；而低濃度的大蒜精油則能夠增加擬桿菌門和厚壁菌門中有益菌的數(shù)量，改善蛋雞的腸道形態(tài)和腸道健康，提營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率，最終提高生長(zhǎng)性能。

4 結(jié) 論

飲水中添加0.04和0.06 mL/L大蒜精油能夠增加蛋雞盲腸中有益菌的種類和數(shù)量，有助于盲腸微生態(tài)平衡的建立，提高盲腸消化能力和免疫機(jī)能，且添加0.06 mL/L大蒜精油能夠有效改善蛋雞十二指腸、空腸和回腸腸道組織形態(tài)，有助于蛋雞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，提高蛋雞的平均日增重，降低料重比，從而提高蛋雞的生長(zhǎng)性能。