董 博 王志林 魏文康,3 井曉歡 劉 石 鄢秋龍 蔣宗勇 劉文華 胡譯尹 陳 莊*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東省農(nóng)作物種質(zhì)資源保存與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510640；2.廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣州510640；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名525000；4.深圳國家基因庫，深圳510083；5.大連醫(yī)科大學(xué)微生物教研室，大連116044；6.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣州510640)

腸道是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、微生物與宿主互作的主要部位。腸道微生物作為腸道生態(tài)系統(tǒng)的重要部分和調(diào)節(jié)因子，其健康狀態(tài)關(guān)系著斷奶仔豬的正常生長和發(fā)育[1]。仔豬斷奶應(yīng)激一直是困擾養(yǎng)豬業(yè)的難題，斷奶前后仔豬胃腸道微生物區(qū)系也發(fā)生劇烈的變化。斷奶前后仔豬胃腸道微生物區(qū)系的基因組學(xué)研究和功能活性的研究已有報(bào)道[2-16]。Li等[2]研究了斷奶前后仔豬結(jié)腸內(nèi)容物的微生物基因組，發(fā)現(xiàn)分別含有1 584和1 157個(gè)操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，其中分別有137和85個(gè)特定OTU。盡管如此，目前人和動(dòng)物腸道微生物組研究中，仍然有超過一半宏基因組測序不能得到明確的菌種信息，更不能獲得分離純化的單菌株，以進(jìn)行表型、功能以及與宿主的互作研究[17-22]，因此需要對傳統(tǒng)的菌株篩選方法進(jìn)行優(yōu)化改造。培養(yǎng)組學(xué)(culturomics)是一種使用多種培養(yǎng)條件和16S rRNA測序相結(jié)合，對樣品中的微生物進(jìn)行系統(tǒng)地篩選分離培養(yǎng)的方法[17,23-32]。培養(yǎng)組學(xué)方法可以將之前認(rèn)為不可培養(yǎng)的菌株培養(yǎng)起來，較大程度地發(fā)現(xiàn)潛在的新菌株，豐富現(xiàn)有的可培養(yǎng)腸道菌株資源庫，為開發(fā)緩解斷奶應(yīng)激的益生菌打下基礎(chǔ)。在畜禽腸道微生物培養(yǎng)組學(xué)研究方面，2017年，F(xiàn)errario等[33]首次利用培養(yǎng)組學(xué)方法對百慕大野雞、蛋雞和肉雞盲腸內(nèi)容物進(jìn)行了培養(yǎng)組研究，獲得并鑒定了417株菌株(包括4個(gè)門、15個(gè)屬和43個(gè)種)，并對相應(yīng)的培養(yǎng)樣本進(jìn)行了宏基因組分析；2018年，Medvecky等[34]培養(yǎng)了雞盲腸內(nèi)容物，共獲得了7個(gè)門、133株不同的厭氧菌種，并全部進(jìn)行了全基因組測序分析，為開發(fā)益生菌提供了較全面的菌株庫和基因資源；2020年，德國馬普所建立并公開了豬的腸道細(xì)菌庫，包括9個(gè)門、39個(gè)科和112個(gè)種，對38個(gè)新的類群進(jìn)行了分類學(xué)描述，包括21個(gè)新種和17個(gè)新屬，并進(jìn)行了擴(kuò)增子和宏基因組測序，以及功能注釋、抗菌分析和益生菌開發(fā)的詳細(xì)研究[35]，上述研究工作還在繼續(xù)。目前國內(nèi)應(yīng)用培養(yǎng)組學(xué)方法在豬腸道微生物全面篩選培養(yǎng)方面和益生機(jī)制的研究才剛剛開始，本研究使用培養(yǎng)組學(xué)方法，對仔豬斷奶前后腸道微生物進(jìn)行全面篩選、培養(yǎng)和鑒定分析。

1 材料與方法

1.1 斷奶前后仔豬腸道內(nèi)容物樣本

選擇斷奶前后的丹系“杜長大”三元雜仔豬各3頭(雌性，健康狀況良好，同一窩仔豬)，分別于18日齡(斷奶前，體重2.8 kg)和60日齡(斷奶后，體重35 kg)屠宰。無菌收集仔豬回腸和結(jié)腸內(nèi)容物，并立即使用培養(yǎng)組學(xué)方法，對樣本中的細(xì)菌進(jìn)行篩選培養(yǎng)。仔豬斷奶前后均未用抗生素。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)方法

選擇25種培養(yǎng)基，包含5%羊血-104、5%羊血-腦心浸液(brain heart infusion，BHI)、5%羊血-DM、5%羊血-GMM、5%羊血-R2A、5%羊血-SCH、5%羊血-孢子、5%羊血-哥倫比亞、Kana-104、Kana-BHI、Kana-哥倫比亞、常規(guī)-104、常規(guī)-2216、常規(guī)-27、常規(guī)-98、常規(guī)-AM、常規(guī)-BHI、常規(guī)-DM、常規(guī)-GMM、常規(guī)-GYM、常規(guī)-NA、常規(guī)-R2A、常規(guī)-SCH、常規(guī)-孢子和常規(guī)-哥倫比亞，分別對樣品進(jìn)行稀釋培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)條件

對每份樣品分別使用厭氧(使用Bactron Ⅳ-2厭氧培養(yǎng)箱，Shellab)和好氧[使用KB240(E5.1)低溫培養(yǎng)箱，Binder]條件進(jìn)行37 ℃培養(yǎng)。

1.2.3 試驗(yàn)過程

樣品處理：好氧處理在超凈工作臺(tái)中，厭氧處理在厭氧培養(yǎng)箱中進(jìn)行。每份樣品分別進(jìn)行好氧和厭氧處理。處理步驟如下：

常規(guī)培養(yǎng)：1)每份樣品取樣各1 g，置于含有9 mL pH 7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)的無菌15 mL離心管中混勻；2)使用pH 7.2的PBS對樣品進(jìn)行10倍系列稀釋；3)每份樣品系列稀釋后為10-1～10-8，每個(gè)稀釋梯度各10 mL；4)選擇10-5、10-6和10-7稀釋梯度，各吸取100 μL稀釋液，在相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布；5)在37 ℃下分別進(jìn)行厭氧和好氧靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行菌株挑取。

富集培養(yǎng)：1)每份樣品取樣各1 g，置于15 mL無菌離心管中，并加入相應(yīng)液體培養(yǎng)基9 mL，振蕩混勻；2)分別置于厭氧、好氧環(huán)境下37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)；3)分別于第1、3、7、10、15、21和30天取1 mL培養(yǎng)物，使用相應(yīng)液體培養(yǎng)基進(jìn)行10-1～10-8系列稀釋；4)取10-5、10-6和10-7稀釋梯度各100 μL涂布于對應(yīng)固體培養(yǎng)基上；5)于恒溫?fù)u床中37 ℃和180 r/min進(jìn)行厭氧和好氧培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行菌株挑取。

1.3 16S rRNA全長測序

應(yīng)用27F和1492R引物分別對每種菌落的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行Sanger測序，獲得約1.5 kb的16S rRNA基因全長序列，并比對到微生物數(shù)據(jù)庫(NCBI數(shù)據(jù)庫和古菌16S rRNA標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫)，相似度>98.65%為確定菌株的種屬，相似度≤98.65%則認(rèn)為此菌株為疑似新種。整個(gè)培養(yǎng)組學(xué)工作流程見圖1。

第三代圖書館服務(wù)平臺(tái)將更加貼近讀者的生活、閱讀需求及知識(shí)獲取和利用方式，為讀者提供高度定制化的服務(wù)。通過對讀者互聯(lián)網(wǎng)社交媒體、多種文化生活場所的集成與覆蓋，對讀者興趣與閱讀行為的深入分析，從資源組織與內(nèi)容服務(wù)等多個(gè)角度實(shí)現(xiàn)對讀者服務(wù)的高度定制化。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)方法和菌株挑取

本研究基于培養(yǎng)組學(xué)方法，使用25種培養(yǎng)基對樣品中的細(xì)菌進(jìn)行篩選培養(yǎng)，共獲得1 385株細(xì)菌。通過觀察涂布平板上的菌落形態(tài)的差異挑取菌株，其中常規(guī)-R2A、常規(guī)-哥倫比亞和常規(guī)-104這3種培養(yǎng)基所篩選挑取的菌株數(shù)目最多，分別為131、114和113株；另外，孢子、DM、BHI、GMM、SCH這4種培養(yǎng)基上菌株也生長情況良好；常規(guī)-GYM、常規(guī)-27、常規(guī)-2216和常規(guī)-AM培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株數(shù)目較少(表1)。

a：仔豬斷奶前后回腸和結(jié)腸內(nèi)容物 ileum and colon contents of piglets before and after weaning；b：樣品先在PBS中稀釋 samples were first diluted in PBS；c：在25種液體培養(yǎng)基采用無氧和有氧條件37 ℃進(jìn)行培養(yǎng) incubate diluted samples in 25 kinds of liquid medium under anaerobic and aerobic conditions at 37 ℃；d：平板篩選的菌落甘油保存并提取基因組DNA用于鑒定 preserve the colonies selected by the corresponding plate in glycerol stock and extract the genomic DNA for identification；e：16S rRNA基因測序分析及菌種鑒定 16S rRNA gene sequencing analysis and strain identification。

表1 每種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株數(shù)目

實(shí)際培養(yǎng)過程中，根據(jù)豬腸道的特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中會(huì)添加一些生長因子，如微量元素、維生素和脫纖維羊血等[36]，盡可能將樣品中的細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)獲得。同時(shí)，涂布平板培養(yǎng)時(shí)間也較重要，大部分培養(yǎng)獲得的菌株，都是在24～48 h中獲得[26]，但是較難培養(yǎng)獲得的菌株一般培養(yǎng)時(shí)長超過48 h[37-38]。對于使用常規(guī)培養(yǎng)方法較難培養(yǎng)的擬桿菌和梭菌屬，其中擬桿菌本研究使用常規(guī)-SCH和Kana-104培養(yǎng)基培養(yǎng)出來了，培養(yǎng)出的擬桿菌均來自仔豬斷奶后結(jié)腸樣本；梭桿菌本研究使用5%羊血-R2A、5%羊血-哥倫比亞、5%羊血-104、5%羊血-R2A、常規(guī)-R2A和常規(guī)-BHI這6種培養(yǎng)基培養(yǎng)出來了，這6種培養(yǎng)基中4種都添加了5%羊血，顯示梭桿菌比較容易用5%的脫纖維羊血培養(yǎng)出來，培養(yǎng)出的這9株梭桿菌除了1株來自回腸，其余8株都來自結(jié)腸樣本，顯示梭桿菌可能和結(jié)腸中降解纖維多糖方面的功能有關(guān)[39]。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 不同培養(yǎng)條件及門、屬、種水平的細(xì)菌鑒定

由表2和表3可知，篩選培養(yǎng)鑒定的1 385株菌株，分布于5個(gè)門、29個(gè)屬和86個(gè)種。仔豬斷奶前回腸細(xì)菌門水平有厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和梭桿菌門(Fusobacteria)3個(gè)門；斷奶后回腸有厚壁菌門和變形菌門這2個(gè)門，此2個(gè)門也存在斷奶前回腸。仔豬斷奶前結(jié)腸菌株分布在厚壁菌門、擬桿菌門(Bacterioidetes)、變形菌門、放線菌門(Actinobacteria)和梭桿菌門；斷奶后結(jié)腸菌株分布在厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門，斷奶后結(jié)腸沒有培養(yǎng)出梭桿菌門。仔豬斷奶前回腸培養(yǎng)了305株菌，結(jié)腸培養(yǎng)了386株菌；斷奶后回腸培養(yǎng)了220株菌，結(jié)腸培養(yǎng)了474株菌(圖2)。

表2 仔豬斷奶前后回腸和結(jié)腸鑒定細(xì)菌門、屬、種分布及需氧厭氧特性

續(xù)表3項(xiàng)目 Items組成 Composition(Corynebacterium xerosis)、6株鉛黃腸球菌(Enterococcus casseliflavus)、17株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、11株海氏腸球菌(Enterococcus hirae)、8株泰國腸球菌(Enterococcus thailandicus)、1株艾伯特埃希菌(Escherichia albertii)、43株大腸桿菌(Escherichia coli)、125株費(fèi)格森埃希菌(Escherichia fergusonii)、10株旱獺埃希菌(Escherichia marmotae)、1株Faecalicatena orotica、10株死亡梭桿菌(Fusobacterium mortiferum)、1株產(chǎn)氣克萊伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、1株肺炎克萊伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、2株嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、2株敏捷乳桿菌(Lactobacillus agilis)、73株淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)、11株Lactobacillus coleohominis、9株卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、11株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、2株格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、60株約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、3株乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、36株黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)、242株羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、16株唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、149株陰道乳桿菌(Lactobacillus vaginalis)、5株埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、1株Novosphingobium aromaticivorans、1株P(guān)aenibacillus polysaccharolyticus、1株索氏梭菌(Paeniclostridium sordellii)、1株狄氏副擬桿菌(Parabacteroides distasonis)、25株P(guān)elistega suis、2株布氏假單胞菌(Pseudomonas brenneri)、2株熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、1株邊緣假單胞菌(Pseudomonas marginalis)、31株草假單胞菌(Pseudomonas poae)、2株平凡假單胞菌(Pseudomonas trivialis)、1株維羅納假單胞菌(Pseudomonas veronii)、2株鮑氏志賀氏菌(Shigella boydii)、68株弗氏志賀氏菌(Shigella flexneri)、23株宋內(nèi)志賀氏菌(Shigella sonnei)、1株森林土源芽孢桿菌(Solibacillus silvestris)、2株松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)、1株人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、1株腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、7株嗜根窄食單胞菌(Stenotrophomonas rhizophila)、13株非解乳糖鏈球菌(Streptococcus alactolyticus)、35株豬腸鏈球菌(Streptococcus hyointestinalis)、10株豬陰道鏈球菌(Streptococcus hyovaginalis)、1株副血鏈球菌(Streptococcus parasanguinis)、4株魯布納鏈球菌(Streptococcus rubneri)、22株豚鼠韋榮氏球菌(Veillonella caviae)、34株麥格納韋榮氏球菌(Veillonella magna)和3株食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)

圖2 仔豬斷奶前后回腸和結(jié)腸篩選菌株韋恩圖比較

2.2.2 仔豬斷奶前后回腸和結(jié)腸細(xì)菌屬種水平比較

由表2可知，在屬種水平，仔豬斷奶前回腸分布有14個(gè)屬、29個(gè)種和305株的細(xì)菌，斷奶后回腸分布有14個(gè)屬、29個(gè)種和220株的細(xì)菌；斷奶前結(jié)腸分布有17個(gè)屬、35個(gè)種和386株的細(xì)菌，斷奶后結(jié)腸分布有22個(gè)屬、66個(gè)種和474株的細(xì)菌。根據(jù)表2總結(jié)的細(xì)菌的好氧厭氧特性來看，厭氧和兼性厭氧菌為1 264株，好氧菌為121株。仔豬結(jié)腸的厭氧菌數(shù)目明顯多于回腸，結(jié)腸的厭氧菌有126株、回腸有62株，這與之前腸道氧含量的結(jié)論[6,9-10]是一致的。另外，仔豬斷奶后回腸和結(jié)腸的厭氧菌和兼性厭氧菌數(shù)目都有很大程度的增加，顯示仔豬斷奶后腸道菌群的多樣性增加，厭氧菌所占菌群的比例也有很大程度的增加。此外，仔豬斷奶前后回腸有92株菌是共有的，結(jié)腸有187株菌是共有的，結(jié)腸共有的比例大于回腸，這表明回腸菌群結(jié)構(gòu)變化大于結(jié)腸(圖2)。

雖然培養(yǎng)組學(xué)方法得到的菌株數(shù)目只能粗略地反映菌種的豐度，但從圖3和圖4可以看出，與斷奶前相比，仔豬斷奶后回腸中乳桿菌屬(Lactobacillus)菌株數(shù)目有很大程度的減少，這與斷奶前仔豬主要食源為母乳，而乳桿菌具有促進(jìn)母乳脂肪消化和吸收的功能是一致的。另外，仔豬斷奶前回腸、結(jié)腸中的潛在致病菌，如韋榮氏球菌屬(Veillonella)、鏈球菌屬(Streptococcus)等菌株數(shù)目都很高，可能是母乳的抗體有較強(qiáng)的保護(hù)作用，而在斷奶后42 d，腸道菌群初步成熟，回腸中這些條件致病菌株數(shù)目就有很大程度的減少。但是，仔豬斷奶后結(jié)腸中蛭弧菌屬(Bdellovibrio)、短桿菌屬(Brevibacterium)、纖維微菌屬(Cellulosimicrobium)、艱難梭菌屬(Clostridioides)、窄食單胞菌屬(Stenotrophomonas)、魏斯氏菌屬(Weissella)、新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤芽孢桿菌屬(Solibacillus)及葡萄球菌屬(Staphy-lococcus)這些菌屬菌株在斷奶前都不存在，總體上斷奶后結(jié)腸菌屬多樣性要高很多，并且斷奶后結(jié)腸中韋榮氏球菌屬、梭桿菌屬(Fusobacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)和巨型球菌屬(Megasphaera)這幾個(gè)屬的菌株數(shù)目有明顯的減少，而斷奶后結(jié)腸中埃希氏桿菌屬(Escherichia)、志賀氏菌屬(Shigella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、纖維微菌屬、艱難梭菌屬和假單胞菌屬這6個(gè)屬菌株數(shù)目明顯增多，芽孢桿菌屬和纖維微菌屬是和纖維素降解有關(guān)的菌，埃希氏桿菌屬和志賀氏菌屬也是大腸中常見的菌屬，也是一種條件致病菌。

圖3 仔豬斷奶前后回腸培養(yǎng)的菌株在屬水平上的分布柱狀圖

圖4 仔豬斷奶前后結(jié)腸培養(yǎng)的菌株在屬水平上的分布柱狀圖

從圖5可以看出，仔豬斷奶前后回腸菌種數(shù)目都為29種，但是從屬水平看，斷奶后回腸中不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、梭菌屬(Clostridium)、埃希氏桿菌屬、梭桿菌屬、Pelistega、志賀氏菌屬、窄食單胞菌屬、鏈球菌屬、韋榮氏球菌屬和魏斯氏菌屬種數(shù)目都下降到0，而斷奶后回腸中芽孢桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬種數(shù)目都有所增加。從圖6可以看出，與斷奶前相比，仔豬斷奶后結(jié)腸中菌種數(shù)目明顯增多，增加的包括梭菌屬、芽孢桿菌屬、腸球菌屬、短桿菌屬、纖維微菌屬、艱難梭菌屬和假單胞菌屬等，而乳桿菌屬等少數(shù)屬種數(shù)目則有所減少。

2.2.3 仔豬斷奶前后腸道微生物培養(yǎng)組學(xué)發(fā)現(xiàn)的疑似新菌種

根據(jù)16S rRNA全長與NCBI微生物數(shù)據(jù)庫結(jié)果比對，相似度≤98.65%即為潛在新菌種[40]，本研究的培養(yǎng)方法一共獲得116株疑似新種(表4)，其中乳桿菌屬最多共53株，其次是假單胞菌屬共18株，平凡假單胞菌(Pseudomonastrivialis)和屎腸球菌(Enterococcusfaecium)各8株，費(fèi)格森埃希菌(Escherichiafergusonii)5株，F(xiàn)aecalicatenaorotica、無害梭菌(Clostridiuminnocuum)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、糖丁酸梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)、黏膜乳桿菌(Lactobacillusmucosae)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)、狄氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)、豬腸鏈球菌(Streptococcushyointestinalis)和魯布納鏈球菌(Streptococcusrubneri)等各1株。

圖5 仔豬斷奶前后回腸培養(yǎng)的菌種在屬水平上的分布柱狀圖

3 討 論

近年來，培養(yǎng)組學(xué)方法在獲得潛在新菌種、豐富可培養(yǎng)菌株資源庫及菌株的益生機(jī)制研究方面，已顯現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢，并已在人體腸道微生物和相關(guān)醫(yī)學(xué)研究中成為新的熱點(diǎn)。在畜牧業(yè)研究領(lǐng)域，培養(yǎng)組學(xué)也已在菌株與宿主相關(guān)作用、病原微生物及益生機(jī)制和動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)方面的研究中顯現(xiàn)出其潛在的優(yōu)勢，但是有關(guān)研究在國內(nèi)卻鮮見報(bào)道。

3.1 培養(yǎng)組學(xué)條件和菌株篩選鑒定

為了盡可能全面地培養(yǎng)腸菌，本研究對仔豬斷奶前后的回腸和結(jié)腸內(nèi)容物組合使用25種培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件(包括厭氧、纖維羊血和營養(yǎng)因子)，還針對腸道菌株篩選的特點(diǎn)，如多會(huì)產(chǎn)生孢子的情況，添加使孢子萌發(fā)的成分，在培養(yǎng)中對樣品進(jìn)行了一些預(yù)處理、預(yù)培養(yǎng)和富集等，共培養(yǎng)獲得1 385株細(xì)菌，與之前的宏基因組研究報(bào)道的1 157～1 584個(gè)OTU[2]比較相對較少，一些宏基因注釋出來的豐度較低的門[如螺旋體門(Spirochaetes)和軟壁菌門(Tenericutes)等]和屬[如羅斯氏菌屬(Roseburia)、多雷亞菌屬(Dorea)、Blautia、普雷沃氏菌屬(Prevotella)等]沒有培養(yǎng)出來[41]，其可能原因是挑菌過程中為了避免過多重復(fù)并沒有全面挑取，或者一些菌種需要更長的平板培養(yǎng)時(shí)間，如螺桿菌屬(Helicobacter)的一些菌種需要幾天的時(shí)間[37]，一些分支桿菌屬(Mycobacterium)的菌種需要幾周的時(shí)間[38]。因此需要對培養(yǎng)組學(xué)方法進(jìn)一步研究開發(fā)，以獲得更全面的豬腸道微生物菌庫[24]。

3.2 仔豬斷奶前后回腸和結(jié)腸微生物培養(yǎng)組學(xué)和測序結(jié)果比較

在門水平上，仔豬斷奶前后回腸和結(jié)腸可培養(yǎng)的菌株分類變化不大，主要分布在厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌門這5個(gè)門，其中厚壁菌門的相對豐度和多樣性最高，這些和之前的宏基因組測序的研究結(jié)果[6]是一致的。宏基因組注釋出來一些豐度較高的屬如乳桿菌屬、巨型球菌屬、芽孢桿菌屬、擬桿菌屬和埃希氏桿菌屬等，培養(yǎng)的結(jié)果中也有，而培養(yǎng)結(jié)果中的新鞘脂菌屬、類芽孢桿菌屬、Paeniclostridium、Pelistega、土壤芽孢桿菌屬和窄食單胞菌屬這些屬未見于一些測序結(jié)果中[8,39,41-44]。可見培養(yǎng)組學(xué)和測序的結(jié)果是互相印證和補(bǔ)充的關(guān)系[31]。測序研究顯示，對仔豬斷奶后利用飼糧纖維比較重要的腸道菌屬梭菌屬、腸球菌屬、葡萄球菌屬[39]在本研究中也培養(yǎng)出來，這些菌可以作為仔豬適應(yīng)斷奶應(yīng)激的候選益生菌。在種水平上，仔豬斷奶前后回腸菌種數(shù)目未有變化，而斷奶后結(jié)腸菌種數(shù)目明顯增多。

表4 仔豬斷奶前后腸道微生物培養(yǎng)組學(xué)發(fā)現(xiàn)的疑似新菌種(相似度≤98.65%)

續(xù)表4最相似屬 Most similar genus最相似種 Most similar species菌株數(shù)目 Strain number/株鏈球菌屬 Streptococcus非解乳糖鏈球菌(Streptococcus alactolyticus)2豬腸鏈球菌(Streptococcus hyointestinalis)1魯布納鏈球菌(Streptococcus rubneri)1韋榮氏球菌屬 Veillonella麥格納韋榮氏球菌(Veillonella magna)1合計(jì) Total116

本研究結(jié)果表明，與斷奶前相比，仔豬斷奶后回腸中乳桿菌豐度發(fā)生了明顯下降。仔豬腸道大部分菌群最開始是從母乳中獲得并定植于腸道[45]，母乳中乳酸菌比例較大，所以斷奶前乳酸菌有優(yōu)勢，斷奶前擬桿菌屬、埃希氏桿菌屬和梭桿菌屬也比較豐富，這與宏基因組測定斷奶前后菌屬的變化結(jié)果相一致[8,12,44]。仔豬斷奶時(shí)會(huì)突然轉(zhuǎn)換到含有谷物和較高粗蛋白質(zhì)的固體飼料[42,45]，在這個(gè)轉(zhuǎn)換期間，宏基因組分析顯示回腸中作為早期病原菌拮抗的主要參與者之一乳桿菌屬的數(shù)量突然減少[6]，而結(jié)腸中梭菌屬和包含大腸桿菌(Escherichiacoli)等變形菌門在內(nèi)的有害菌在斷奶后都有增加，擬桿菌屬則有所減少[12]，這與本研究的仔豬斷奶前后結(jié)腸培養(yǎng)結(jié)果是一致的，這些菌屬的變化大大增加患胃腸疾病的風(fēng)險(xiǎn)。斷奶后，腸道菌群逐漸成熟，擬桿菌門豐度又逐漸上升[44]；培養(yǎng)結(jié)果顯示斷奶應(yīng)激降低了仔豬回腸種屬多樣性[42]，而斷奶后結(jié)腸菌種多樣性的提高是由于可被結(jié)腸微生物代謝的纖維和多糖類飼糧的添加，這與宏基因組α多樣性研究的結(jié)果是一致的；剛斷奶的仔豬腸道菌屬多樣性先降低，然后從斷奶后期到長成期又會(huì)上升，并超過剛斷奶期[39,43]。

本研究中，仔豬回腸和結(jié)腸培養(yǎng)的菌群在門水平有很大不同，這與宏基因組數(shù)據(jù)結(jié)果一致，回腸培養(yǎng)出的主要菌群是厚壁菌門，占95%以上[6]，而結(jié)腸中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門都有一定比重，其中厚壁菌門和擬桿菌門總共占比超過90%，這和宏基因組門水平變化趨勢研究結(jié)果[41]是一致。這種變化趨勢從培養(yǎng)組學(xué)結(jié)果來看回腸中存在厭氧桿菌屬(Anaerobacter)和Turicibacter較多，而結(jié)腸中存在普雷沃氏菌屬、顫桿菌屬(Oscillibacter)和琥珀酸弧菌屬(Succinivibrio)較多[9]。宏基因組結(jié)果顯示，在屬水平上，斷奶后擬桿菌屬讓位于梭菌屬[13,45]，這與本研究結(jié)果一致。結(jié)腸比回腸的含氧量要低，pH更高，適合多種厭氧和兼性厭氧菌生存。本研究中，雖然腸道菌群總體上厭氧菌占優(yōu)勢，但是結(jié)腸的厭氧菌和兼性厭氧菌的總和要明顯高于回腸相應(yīng)的比例[9,41]。

3.3 培養(yǎng)出來的潛在新菌種

本研究中，共發(fā)現(xiàn)了116株疑似新菌，更多菌株是第1次在豬腸道中發(fā)現(xiàn)，可以豐富有潛在應(yīng)用價(jià)值細(xì)菌的豬腸道細(xì)菌庫，有效拓展對仔豬腸道菌群多樣性和仔豬腸道菌群及營養(yǎng)代謝關(guān)系的認(rèn)識(shí)，實(shí)現(xiàn)對潛在益生菌更全面有效地捕獲。

不同豬品系遺傳因素對腸道菌群種屬水平的影響較大，對15周齡的純種豬品系如“杜洛克”、“長白”和“約克夏”品系之間的比較顯示，這3種品系的腸道菌群在門水平上具有較高的一致性，均為擬桿菌門和厚壁菌門占主要，但是在屬水平上，鏈型桿菌屬(Catenibacterium)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)和Subdoligranulum在“杜洛克”品系中更豐富，而小桿菌屬(Dialister)在“約克夏”品系中更豐富[13]。因此，以后可以開展對中國本地豬的腸道培養(yǎng)研究，豐富豬腸道菌種庫的遺傳背景異質(zhì)性，獲取更全面的新型腸道細(xì)菌菌株資源。本研究證明，通過培養(yǎng)組學(xué)分離出的很多仔豬腸道菌群的多樣性和豐度是迄今未知，這擴(kuò)大了可培養(yǎng)的仔豬腸道微生物資源。

綜上所述，只有通過各種培養(yǎng)方法，將樣品中的微生物在實(shí)驗(yàn)室全面地篩選獲得，并對其進(jìn)行全基因組測序分析及功能注釋，才能從根本上豐富腸道微生物菌種資源庫和功能基因庫，擴(kuò)展對腸道菌群的全面認(rèn)識(shí)，為仔豬營養(yǎng)研究和飼料益生菌制劑開發(fā)打下基礎(chǔ)[23,28]。

本研究采用培養(yǎng)組學(xué)方法研究健康仔豬腸道微生物譜，其研究已深入到菌種水平，優(yōu)于現(xiàn)有的基于二代測序技術(shù)的免培養(yǎng)分析方法。通過培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)，我們能夠發(fā)現(xiàn)潛在的新菌種，后續(xù)也能夠?qū)@些菌種進(jìn)行全基因組測序分析及益生菌開發(fā)。并能夠?qū)Λ@得的豬源益生菌進(jìn)行益生機(jī)制深入研究。益生菌具有物種特異性，相比其他來源的益生菌，豬源性益生菌開發(fā)為微生態(tài)制劑，應(yīng)用在豬營養(yǎng)調(diào)控上，將增加其定植概率和功效發(fā)揮[44,46]，幫助在無抗養(yǎng)殖背景下解決仔豬斷奶應(yīng)激問題。

因此，在目前豬腸道基因集已經(jīng)構(gòu)建的基礎(chǔ)上，展望未來的豬腸道微生物組學(xué)和營養(yǎng)研究是多組學(xué)、純培養(yǎng)和生態(tài)特征的整合分析[44,47]。未來會(huì)針對培養(yǎng)的菌種庫，基于比較基因組的方法，以菌種或亞種為單位研究不同菌種的遺傳多樣性，比較風(fēng)險(xiǎn)因子、功能代謝特性和菌株互補(bǔ)情況，展示常見益生菌的基因組特性及與生態(tài)位的關(guān)系，為解決仔豬斷奶應(yīng)激的益生菌的選擇和復(fù)配提供參考。

4 結(jié) 論

本研究使用培養(yǎng)組學(xué)方法，對仔豬斷奶前后腸道微生物進(jìn)行全面篩選培養(yǎng)，共篩選獲得1 385株厭氧、好氧及兼性厭氧菌株，共計(jì)獲得5個(gè)門、29個(gè)屬和86個(gè)種菌，其中包含梭桿菌、擬桿菌等在以前的研究中較難分離獲得的菌株，以及一些如乳酸菌等具有潛在應(yīng)用價(jià)值的益生菌，更為重要的是其中包含116株疑似新菌種。

致謝：

感謝深圳國家基因庫的趙姣博士、廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所彭新宇研究員、深圳倍森生物科技有限公司李勝輝工程師和中山大學(xué)生物技術(shù)系黃昱祈對文稿所提的寶貴意見。