廣東省深圳市大鵬婦幼保健院（518120）胡春青 劉玉美 唐曉勇 雷永革

URSA是臨床婦產(chǎn)科較為常見的疾病，即指發(fā)生連續(xù)兩次及以上，無(wú)法找到明確原因的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[1]。近年來，隨著人們生活方式的改變，臨床中URSA發(fā)生率呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，不僅對(duì)女性順利生育造成影響，且對(duì)社會(huì)、夫妻生活造成一系列問題。有文獻(xiàn)顯示，早期URSA發(fā)生中，TAFI水平表達(dá)異常；TAFI高水平表達(dá)，對(duì)降低URSA風(fēng)險(xiǎn)具有一定作用。鑒于此，本研究將100例URSA患者作為研究對(duì)象，對(duì)TAFI基因CPB2單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2019年7月～2020年6月我院和深圳市光明區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的100例URSA患者作觀察對(duì)象，將其設(shè)為觀察組；所有患者均符合相關(guān)診斷標(biāo)注，患者年齡18～40歲，平均（28.1±7.2）歲。篩選同期正常健康孕齡期女性200例，年齡19～39歲，設(shè)為對(duì)照組，平均年齡（27.5±6.8）歲，其中非孕100例、在孕100例。兩組婦女基本資料均衡可比（P＞0.05）。

1.2 方法 所有研究對(duì)象均于清晨空腹抽取外周靜脈血5ml，其中3ml于一次無(wú)抗凝劑的干燥管內(nèi)于室溫靜置30min后，離心(3500r/min)5min，用作檢測(cè)血清中PAI-1水平。另外2ml靜脈血于乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝管內(nèi)，混勻，用于PAI-1基因單核苷酸多態(tài)性分析。所有樣本均于-20℃保存?zhèn)溆茫y(tǒng)一進(jìn)行批檢。

儀器與試劑：AE275全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀試劑購(gòu)于上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司；DNA 提取試劑盒購(gòu)于美國(guó)AXYGEN公司；ABI7500型實(shí)時(shí)定量突光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀由美國(guó)ABI公司提供；基因SNP多態(tài)性分析試劑盒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司。

附表1 兩組CPB2 SNPs基因型與等位基因頻率分布

附表2 兩組CPB2 SNPs連鎖不平衡分析

附表3 兩組PAI-1基因4G/5G多態(tài)性分布

PAI-1水平檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中PAI-1水平，操作均嚴(yán)格按試劑和儀器說明書進(jìn)行，檢測(cè)前對(duì)儀器進(jìn)行保養(yǎng)、校正，檢測(cè)時(shí)同時(shí)設(shè)計(jì)空白孔、陰陽(yáng)孔及質(zhì)控孔，待上述所有檢測(cè)孔的OD值均在參考有效范圍內(nèi)才進(jìn)行標(biāo)本結(jié)果判讀，否則重新進(jìn)行檢測(cè)。

PAI-1基因單核苷酸多態(tài)性分析[2]：（1）基因DNA提?。菏褂肈NA提取試劑盒抽提標(biāo)本中DNA；（2）PCR法目的片段擴(kuò)增；（3）引物設(shè)計(jì)：參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)PCR引物序列（廣州金域檢測(cè)中心提供），PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)引物序列：①4G上游引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGA-3′；②5G上游引物：5′-GTCTGGACACGTGGGGG-3′；③陽(yáng)性對(duì)照上游引物：5′-AGCTTTTACCATGGTAACCCC T G G T-3′；④共同下游引物：5′-CAGGTCACTGTGGAGTTATC-3′。4G和5G分別在2個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行：一管加入引物①、③、④；另一管加入引物②、③、④。經(jīng)PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳。

結(jié)果判斷[3]：4G和5G的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度均為135bp，陽(yáng)性對(duì)照段PCR產(chǎn)物長(zhǎng)為256bp，若只出現(xiàn)4G則為4G/4G基因型；只出現(xiàn)5G則為5G/5G基因型；4G和5G同時(shí)出現(xiàn)為4G/5G基因型。部分PAI-1基因單核苷酸多態(tài)性分析將送往廣州華銀檢驗(yàn)中心進(jìn)行檢測(cè)、確認(rèn)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué) 將數(shù)據(jù)納入SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用x2比較，以率（%）表示；計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，以（±s）表示，若P＜0.05則表示差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CPB2 SNPs基因型與等位基因頻率分布 研究顯示，rs1926447、Rs2277440、Rs9316179、Rs7337140、Rs3742264、Rs2296642等6個(gè)已知SNP點(diǎn)位在兩組中分布符合Hardy-Weinberg平衡，且呈現(xiàn)多態(tài)性（P＞0.05）。觀察組Rs9316179等位基因C、Rs7337140等位基因G、Rs3742264等位基因A、Rs2296642等位基因C頻率分布均低于對(duì)照組（P＜0.05）；經(jīng)Bonferroni多重檢驗(yàn)校正分析顯示，兩組婦女Rs9316179、Rs7337140基因型、等位基因頻率分布對(duì)比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見附表1。

2.2 分析GPB2 SNPs連鎖不平衡 研究顯示，觀察組婦女Rs3742264-rs9316179點(diǎn)位組合中GGTT頻率顯然高于對(duì)照組婦女，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且經(jīng)FDR、Bonfermni多重檢驗(yàn)校正結(jié)果顯示P＜0.05，詳見附表2。

2.3 兩組PAI-1基因4G/5G多態(tài)性分布 研究顯示，觀察組URSA患者等位基因4G、基因型頻率4G/4G顯然高于對(duì)照組（P＜0.05）；與5G/5G基因型比較，URSA的發(fā)生與4G純合子?jì)D女、攜帶4G等位基因婦女相關(guān)，OR為4.822、2.810。而同時(shí)兼有PAI-1基因4G/4G基因型患者，發(fā)生URSA風(fēng)險(xiǎn)更高（P＜0.01）（CI：2.294～7.366），詳見附表3。

3 討論

URSA是臨床婦產(chǎn)科常見疾病，其病因復(fù)雜，目前尚不完全清楚，大部分學(xué)者認(rèn)為與男性精液異常、內(nèi)分泌失調(diào)、感染性疾病、解剖學(xué)結(jié)構(gòu)畸形、遺傳異常等存在相關(guān)性。一般而言，健康女性妊娠期機(jī)體中纖維蛋白溶解酶、抗凝物質(zhì)水平下降，促凝血因子水平呈現(xiàn)升高，機(jī)體血液呈現(xiàn)高凝狀態(tài)，極大增加妊娠期高危并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)；且孕婦長(zhǎng)期處于這種狀態(tài)，可造成外周凝血功能異常，胎盤微血管血栓風(fēng)險(xiǎn)增高，對(duì)胎兒血供、胎盤血供造成影響，增加流產(chǎn)發(fā)生率[4]。

目前，已有研究認(rèn)為，在局部凝血-纖溶系統(tǒng)中TAFI對(duì)精確調(diào)控起到重要作用。TAFI介導(dǎo)的蛋白C介導(dǎo)凝血抑制與纖溶抑制，在血栓調(diào)節(jié)蛋白作用下，可對(duì)機(jī)體凝血功能進(jìn)行精確調(diào)控，同時(shí)對(duì)血栓引起的下游炎癥反應(yīng)起到共同抑制效果，同時(shí)，TAFI不影響血栓外正常凝血功能，僅對(duì)局部纖溶抑制進(jìn)行調(diào)控。目前，已有較多研究證實(shí)，CPB2基因多態(tài)性點(diǎn)位與突變點(diǎn)位與TAFI相關(guān)[5]。

本研究經(jīng)Bonferroni多重檢驗(yàn)校正分析顯示，兩組婦女Rs9316179、Rs7337140基因型、等位基因頻率分布對(duì)比P＜0.05，與URSA發(fā)生呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。觀察組婦女Rs3742264-rs9316179點(diǎn)位組合中GGTT頻率顯然高于對(duì)照組婦女（P＜0.05），且經(jīng)FDR、Bonfermni多重檢驗(yàn)校正結(jié)果顯示P＜0.05，因此，本研究認(rèn)為，rs9316179不具有臨床效應(yīng)，在兩組rs9316179分布差異中由強(qiáng)連鎖導(dǎo)致。

PAI-1具有防止血栓形成的功能，被認(rèn)為是纖溶酶原激活物主要抑制因子。當(dāng)該基因點(diǎn)位突變是纖溶酶原激活物（PA）與PAI動(dòng)態(tài)平衡被打破，PA與PAI-1結(jié)合，形成一種無(wú)活性、穩(wěn)定的復(fù)合物，增加血栓形成風(fēng)險(xiǎn)[6]。有研究認(rèn)為，PAI-1基因轉(zhuǎn)錄與PAI-1基因啟動(dòng)區(qū)域4G等位基因相關(guān)，有助于促進(jìn)該基因表達(dá)[7]?；颊唧w內(nèi)PAI-1水平中，5G/5G型體內(nèi)PAI-1濃度最低、4G5G雜合子基因攜帶者次之、4G4G純合子基因攜帶者濃度最高[8]。

本研究顯示，URSA患者等位基因4G、基因型頻率4G/4G顯然高于對(duì)照組（P＜0.05）；與5G/5G基因型比較，URSA的發(fā)生與4G純合子?jì)D女、攜帶4G等位基因婦女相關(guān)，OR為4.822、2.810。而同時(shí)兼有PAI-1基因4G/4G基因型患者，發(fā)生URSA風(fēng)險(xiǎn)更高（P＜0.01）（CI：2.294～7.366）。

綜合以上，URSA婦女中普遍存在CPB2基因遺傳易感，PAgT（ADP）水平在rs3742264基因型間存在差異，rs3742264等位基因A是URSA保護(hù)等位基因，對(duì)婦女妊娠具有積極作用；PAI-1基因4G/5G多態(tài)性與URSA發(fā)生存在密切相關(guān)性。