梁 猛,周今朝,孫訓英,賀超凡,張克甲,胡 柯
蚌埠醫(yī)學院生命科學學院,安徽 蚌埠 233030
雌激素雙酚A(BPA)是由兩個不飽和酚環(huán)組成的單體,其結構與己烯雌酚類似,具有弱雌激素活性[1-4]。BPA與雌性生殖細胞的分子功能存在顯著關聯(lián),其能夠降低卵母細胞質(zhì)量,影響減數(shù)分裂,進而調(diào)控卵母細胞發(fā)育[5-8]。BPA暴露顯著促進小鼠卵巢組織中凋亡相關的支架附著因子B樣轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白表達,進而抑制小鼠卵泡發(fā)育[9]。BPA能夠阻止小鼠有腔卵泡顆粒細胞G2期向M期過渡,誘導細胞凋亡[10]。哺乳動物腔前卵泡顆粒細胞對于卵泡早期發(fā)育的激素及營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控至關重要,而關于BPA對小鼠腔前卵泡顆粒細胞的調(diào)控研究,目前暫無報道。本研究通過體外培養(yǎng)腔前卵泡顆粒細胞和孕鼠體內(nèi)暴露模型,探討B(tài)PA對腔前卵泡顆粒細胞和孕鼠及子代雌鼠卵巢的影響。深入研究不同BPA濃度暴露對于對體外卵巢腔前卵泡顆粒細胞功能和孕鼠及子代雌鼠卵巢發(fā)育調(diào)控,將揭示BPA對早期卵泡發(fā)育的濃度依賴分子機制,并為臨床制定有效的預防措施提供參考。
FBS、雙抗和 DMEM/F12(Life Technologies),CCK-8(Dojindo Laboratories),胰酶,細胞周期檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、BCA試劑、SDS-PAGE凝膠和JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天),Protease inhibitor cocktail(Roche),RIPA 裂解液(Millipore),Trizol試劑(Invitrogen),PrimeScriptTMRT reagent kit和TBGreenTMPremixExTaqTMII kit(TaKaRa)。
ICR雌鼠由蚌埠醫(yī)學院實驗動物中心提供,選取10~12 d雌鼠分離卵巢腔前卵泡顆粒細胞[11],選取懷孕8 d孕鼠進行BPA(索萊寶)體內(nèi)暴露實驗。分離出的顆粒細胞培養(yǎng)在5% CO2和37℃培養(yǎng)箱中,所用培養(yǎng)基為添加10% FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將BPA用茶油溶解,以檢測到陰道栓作為受孕第1天,從小鼠受孕第8天開始,根據(jù)孕鼠質(zhì)量進行特定劑量BPA的灌胃處理,持續(xù)1周,以后正常飼養(yǎng)。本研究經(jīng)過蚌埠醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準。
為了研究BPA對腔前卵泡顆粒細胞的增殖效應,將細胞傳至96孔板培養(yǎng)24 h,用不同濃度BPA處理48 h后,加入CCK-8試劑孵育2 h,使用酶標儀讀取450 nm吸光度來測定細胞增殖情況。
腔前卵泡顆粒細胞傳至6孔板培養(yǎng)24 h,給予不同濃度的BPA進行處理48 h,每孔加入0.5 mL胰酶進行貼壁細胞的消化,3 min后加入細胞培養(yǎng)液終止消化并收集細胞,再用預冷PBS洗滌并收集細胞。預冷70%乙醇重懸細胞,輕輕顛倒混勻,4℃固定3 h,離心收集細胞。按照細胞周期檢測試劑盒說明書配制所需體積的染色液,向樣品中加入0.5 mL染色液,37℃避光染色30min,利用流式細胞儀檢測細胞周期情況。
腔前卵泡顆粒細胞傳至6孔板培養(yǎng)24 h,給予不同濃度的BPA進行處理48 h,胰酶消化3 min,用移液器將各孔中懸浮細胞以及貼壁的細胞轉(zhuǎn)移至離心管中,預冷PBS洗滌細胞2次。按照細胞凋亡檢測試劑盒說明書,向樣品中加入100 μL的染色結合液(1X)輕輕吹打重懸細胞。再向細胞樣品中加入5 μLAnnexin V-FITC,然后加入10 μLPI,室溫避光染色15 min。最后向每管加入0.5 mL的染色結合液(1X)重懸,利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
腔前卵泡顆粒細胞傳至6孔板培養(yǎng)24 h,給予不同濃度的BPA進行處理48 h,棄掉培養(yǎng)液,PBS洗滌細胞1次,再向每孔加入1 mL細胞培養(yǎng)液。按照JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書,每孔加入1 mLJC-1工作液,充分混勻,37℃避光染色20 min。染色結束后棄上清,預冷JC-1染色緩沖液(1X)洗滌2次,每孔加入2 mL細胞培養(yǎng)液,熒光顯微鏡拍照。
通過含有1% Protease inhibitor cocktail的RIPA裂解液提取腔前卵泡顆粒細胞的總蛋白,使用BCA試劑測定蛋白濃度,確定上樣量。配置SDS-PAGE凝膠,上樣后進行電泳(80V20min,然后切換成120V70min),用工具將凝膠取出,切去濃縮膠,放入轉(zhuǎn)膜槽中進行轉(zhuǎn)膜(300 mA 90 min)。轉(zhuǎn)膜結束后,5%脫脂奶粉封閉2 h,洗膜液清洗1次,一抗4℃冰箱孵育過夜。將孵育過夜的膜用洗膜液洗滌3次(每次10 min),二抗室溫孵育1 h,再用洗膜液洗滌4次(每次10 min),最后使用凝膠成像儀(Bio-rad)采集圖像。
Trizol試劑提取小鼠卵巢組織的總RNA,整個實驗過程嚴格在無RNA酶環(huán)境中進行,操作步驟參考試劑說明書。使用PrimeScriptTMRT reagent kit將所提取組織的總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,再利用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII kit進行qPCR檢測分析。以β-actin mRNA為內(nèi)參,檢測Bcl-2mRNA表達水平。Bcl-2和βactin的引物序列如下:Bcl-2 Fw:CTGAGTACCTGAA CCGGCAT,Bcl-2 Rv:GGTATGCACCCAGAGTGAT G,β-actin Fw:TTCTACAATGAGCTGCGTGTG,βactinRv:GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA。
取小鼠卵巢組織塊,4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切片(5 μm),并進行石蠟切片脫蠟和水化,蘇木素染液染色,再進行脫水和透明,中性樹膠封片,最后顯微鏡觀察并拍照。
采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理,并以平均數(shù)±標準差表示,用單因素方差分析組間差異性,P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。
通過體外分離培養(yǎng)卵巢腔前卵泡顆粒細胞,利用不同濃度的BPA處理,發(fā)現(xiàn)與對照組比較,低濃度BPA(50μmol/L)能夠顯著促進細胞增殖,而高濃度BPA(200和500μmol/L)能夠明顯抑制細胞增殖(圖1)。
圖1 Bisphenol調(diào)控腔前卵泡顆粒細胞增殖Fig.1 Bisphenol regulates proliferation of preantral follicular granulosa cells.CCK-8 assay was used to detect the proliferation of preantral follicular granulosa cells treated with different concentrations of Bisphenol.*P<0.05 vs controlgroup.
通過流式細胞儀檢測細胞周期,發(fā)現(xiàn)不同濃度BPA處理對細胞周期無顯著差異(圖2)。
圖2 BPA對腔前卵泡顆粒細胞周期無顯著影響Fig.2 Bisphenol(BPA)has no significant effects on cell cycle of preantral follicular granulosa cells.A:Flow cytometric analysis of cell cycle of preantral follicular granulosa cells treated with different concentrations of BPA.B:Cell cycle distribution of the treated cells.
流式細胞儀檢測不同濃度BPA處理腔前卵泡顆粒細胞凋亡情況,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,低濃度BPA(50 μmol/L)能夠顯著抑制細胞凋亡,而高濃度BPA(200μmol/L)能夠明顯促進細胞凋亡(圖3)。
圖3 BPA調(diào)控腔前卵泡顆粒細胞凋亡Fig.3 Bisphenol(BPA)regulates apoptosis of preantral follicular granulosa cells.A:Flow cytometric analysis of apoptosis of preantral follicular granulosa cells treated with different concentrations of BPA.B:Quantitative analysis of apoptotic cell rates.*P<0.05vs control group.
免疫熒光結果顯示,與對照組相比,低濃度BPA(50μmol/L)紅色熒光顯著增強,高濃度BPA(200μmol/L)綠色熒光顯著增強(圖4A)。流式細胞儀檢測結果顯示,低濃度BPA(50 μmol/L)紅色熒光和綠色熒光的比值顯著增加,高濃度BPA(200 μmol/L)紅色熒光和綠色熒光的比值明顯降低(圖4B、C)。
圖4 BPA調(diào)控腔前卵泡顆粒細胞線粒體膜電位Fig.4 Bisphenol(BPA)regulates mitochondrial membrane potential of preantral follicular granulosa cells.A:Immunofluorescence assay of mitochondrial membrane potential in preantral follicular granulosa cells treated with BPA.B:Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential of the cells.C:Quantitative analysis of mitochondrial membrane potential in different groups.*P<0.05vscontrol group.
低濃度BPA(50 μmol/L)促進凋亡負調(diào)控蛋白Bcl-2表達,抑制凋亡正調(diào)控蛋白Bax和p53表達;高濃度BPA(200 μmol/L)抑制凋亡負調(diào)控蛋白Bcl-2表達,促進凋亡正調(diào)控蛋白Bax和p53表達;低濃度BPA(50 μmol/L)和高濃度BPA(200 μmol/L)對細胞周期蛋白CyclinD1均無顯著影響(圖5)。
圖5 BPA調(diào)控凋亡蛋白表達Fig.5 Bisphenol(BPA)regulates apoptotic protein expression.A:Western blotting of Bel-2,Bax,p53,and cyclin D1 expressions in preantral follicular granulosa cells treated with different concentration of BPA.B:Quantitative analysis of the protein expressions.*P<0.05vscontrol group,**P<0.01vscontrol group.
為了深入探究BPA在體內(nèi)對卵巢發(fā)育的影響,根據(jù)體外效應顯著的BPA濃度(50和200 μmol/L),利用摩爾濃度和質(zhì)量濃度關系,并參考Wei et al.研究[12],換算成小鼠使用濃度(10和35 mg/kg),通過灌胃處理ICR孕鼠1周進行體內(nèi)BPA暴露,之后檢測孕鼠及子代雌鼠卵巢發(fā)育情況(圖6A)。從BPA處理孕鼠開始記錄孕鼠體質(zhì)量變化,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,BPA(10和35 mg/kg)處理組的孕鼠體質(zhì)量增加較快,并且子代出生后母鼠體質(zhì)量仍有差異(圖6B)。對不同天數(shù)子代卵巢進行HE染色,結果顯示在21 d時高劑量BPA(35 mg/kg)能夠使卵泡發(fā)育加速進入有腔卵泡階段(圖6C)。通過分析子代雌鼠卵巢指數(shù),發(fā)現(xiàn)在10 d時低劑量BPA(10 mg/kg)顯著增加卵巢指數(shù),在17 d時高劑量BPA(35 mg/kg)顯著增加卵巢指數(shù),21 d時低劑量和高劑量BPA(10 mg和35 mg/kg)均能顯著增加卵巢指數(shù),隨著子代天數(shù)的增加,這種效應逐漸減弱(圖6D)。qPCR結果顯示,凋亡負調(diào)控蛋白Bcl-2表達與子代卵巢指數(shù)的變化基本一致(圖6E)。
BPA在機體卵泡液、胎盤組織、尿液及血液等組織,可以干擾卵泡發(fā)育,與流產(chǎn)、多囊卵巢綜合征和不孕等疾病密切相關[12-16]。本研究揭示,BPA能夠通過調(diào)控卵巢腔前卵泡顆粒細胞線粒體膜電位,影響細胞凋亡,進而對細胞發(fā)揮重要功能,同時其作用具有濃度依懶性;體內(nèi)暴露實驗證明,BPA對孕鼠和子代雌鼠卵巢發(fā)育具有潛在影響。
BPA對細胞功能的調(diào)控,具有細胞種類和濃度依懶性。BPA能夠誘導前列腺癌細胞周期停滯,主要通過激活EGFR/ERK信號通路[17]。BPA通過上調(diào)CyclinD1等細胞周期基因表達,加速G1/S期轉(zhuǎn)化,進而促進乳腺癌細胞增殖[18]。BPA能夠減弱甲狀腺素誘導的豬卵巢顆粒細胞凋亡[5]。BPA可以通過雌激素受體途徑刺激HBL-100細胞增殖和細胞分裂[19]。本研究揭示,在體外培養(yǎng)的卵巢腔前卵泡顆粒細胞中,低濃度BPA(50μmol/L)促進凋亡負調(diào)控蛋白Bcl-2表達,抑制凋亡正調(diào)控蛋白Bax和p53表達,升高線粒體膜電位,抑制細胞凋亡,從而促進細胞增殖;高濃度BPA(50 μmol/L)抑制凋亡負調(diào)控蛋白Bcl-2表達,促進凋亡正調(diào)控蛋白Bax和p53表達,降低線粒體膜電位,促進細胞凋亡,從而抑制細胞增殖。體外實驗結果證明,BPA對于卵巢腔前卵泡顆粒細胞功能調(diào)控具有顯著的濃度依懶性。
研究報道BPA在體內(nèi)能夠發(fā)揮效用,引起動物組織不同程度損傷[20-22]。BPA通過激活ERK1/2途徑誘導心臟纖維化,其是眾所周知的誘導脂肪形成的致肥胖物[23-24]。成年雄性小鼠BPA暴露能夠使得肺部的嗜酸性粒細胞異常,導致肺部損傷[25]。BPA能夠通過阻斷RNA剪接,導致后代雄性小鼠睪丸發(fā)育異常[26-27]。BPA還能夠破壞生殖細胞減數(shù)分裂過程中雙鏈斷裂修復機制,導致染色體分離異常,從而引起一系列生殖疾?。?8-30]。本研究證明,在孕鼠BPA體內(nèi)暴露中,BPA(10和35 mg/kg)顯著增加孕鼠質(zhì)量,并增加子代雌鼠卵巢指數(shù),凋亡負調(diào)控蛋白Bcl-2表達與子代雌鼠卵巢指數(shù)變化基本一致,高劑量BPA(35 mg/kg)能夠促進21 d子代雌鼠卵泡發(fā)育加速進入有腔卵泡階段。隨著子代天數(shù)的增加,這一系列效應逐漸減弱。體內(nèi)實驗結果證明,BPA暴露能夠加快孕鼠體質(zhì)量升高和增加子代雌鼠卵巢指數(shù)。對于BPA在體內(nèi)詳細的代謝過程及分子機制,有待于將來的深入研究。
綜上所述,本研究利用體外和體內(nèi)實驗,證明BPA對體外卵巢腔前卵泡顆粒細胞功能調(diào)控具有濃度依懶性,對孕鼠和子代雌鼠卵巢發(fā)育具有潛在影響。