方迎艷，蘇振宏，司文霞，劉圓呈，李 潔，曾 鵬

1湖北理工學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖北 黃石 435003；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，湖北 武漢 430030

阿爾茨海默?。ˋD）是最為常見的一種神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為不可逆的神經(jīng)元死亡和進(jìn)展性的認(rèn)知功能障礙，約有60%～80%的癡呆病例與AD有關(guān)［1-2］。AD的發(fā)病機(jī)制至今仍不清楚，美國FDA批準(zhǔn)了5種藥物用于AD的治療：多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏、美金剛和Namzaric?（多奈哌齊和美金剛緩釋劑的組合）［3］，其中多奈哌齊、利凡斯的明、加蘭他敏為乙酰膽堿酯酶抑制劑，美金剛為NMDA受體拮抗劑。上述AD治療藥物均為對癥治療且療效有限，因此尋找能直接針對AD病理改變的候選藥物并闡明其作用機(jī)制具有重要意義。

白藜蘆醇（RES）是從多種水果中提取的非黃酮類多酚化合物［4-5］。由于RES具有抗氧化、抗炎和抗微生物等特性［6］，其治療潛力已被廣泛研究。據(jù)報道，RES在AD、癲癇、帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化癥和神經(jīng)損傷的體外模型中均顯示出明顯的治療效果［6-7］。雖然RES在不同的行為測試中可改善認(rèn)知功能［8-9］，但RES治療AD仍缺乏體內(nèi)與臨床研究證據(jù)。因此，有必要系統(tǒng)深入的對RES治療AD的藥理作用進(jìn)行研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可系統(tǒng)、便捷的揭示藥物活性成分與疾病靶點(diǎn)之間潛在的復(fù)雜相互作用，進(jìn)而檢測這種相互作用對系統(tǒng)功能和行為的影響［10］。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出RES治療AD的靶點(diǎn)，并對靶蛋白進(jìn)行GO生物學(xué)過程及KEGG通路分析，明確RES治療AD的核心靶點(diǎn)與潛在分子機(jī)制，在AD細(xì)胞模型中進(jìn)行了初步驗證，為進(jìn)一步實驗及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 收集RES作用靶點(diǎn)

使用 PubChem 數(shù)據(jù)庫［11］（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取RES的Canonical SMILES編號，將所得編號輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫［12］（http://www.swisstargetprediction.ch/）篩選RES作用靶點(diǎn)。此外，進(jìn)一步使用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫［13］（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）查詢RES潛在靶點(diǎn)，合并兩數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)使用Excel表格去重后得到RES所有作用靶點(diǎn)。

1.2 AD靶點(diǎn)的獲取

以“Alzheimer's disease”為關(guān)鍵詞在Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、AD數(shù)據(jù)庫［14］（https://www.cbligand.org/AD/login.php）以及TTD數(shù)據(jù)庫［15］（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）查詢?nèi)祟?AD 靶點(diǎn)。對1.1中RES作用靶點(diǎn)與AD靶點(diǎn)使用Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）工具取交集，獲得RES治療AD的靶點(diǎn)。進(jìn)一步使用Panther數(shù)據(jù)庫（http://www.pantherdb.org/）對RES治療AD靶點(diǎn)進(jìn)行功能分類。

1.3 構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將RES與AD共同靶點(diǎn)上傳至String 11.0數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，設(shè)定置信度大于0.4，獲得靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)（nodes）代表靶蛋白，邊（edges）代表靶蛋白與靶蛋白之間存在相互作用。度值（degree）為網(wǎng)絡(luò)圖中一個節(jié)點(diǎn)的與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)量，度值越高該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越重要。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)出為tsv格式文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件［16］（https://cytoscape.org/）使用 Cytohubba插件根據(jù)度值篩選核心靶點(diǎn)。

1.4 基因本體論(GO)與KEGG通路富集分析

Metascape［17］（https://metascape.org/gp）是一 個 功能強(qiáng)大的基因功能注釋分析工具，使用Metascape對RES治療AD靶蛋白進(jìn)行GO生物學(xué)過程與KEGG信號通路富集分析。分析閾值設(shè)置為最小富集因子Enrichment為1.5、最小重疊靶點(diǎn)為3以及P＜0.01。使用微生信在線繪圖網(wǎng)站（www.bioinformatics.com.cn）對GO生物學(xué)過程與KEGG通路富集結(jié)果繪制氣泡圖與KEGG信號通路圖。

1.5 構(gòu)建“靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖

為直觀的顯示RES治療AD的靶點(diǎn)參與KEGG信號通路情況，使用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建“靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 AlzData數(shù)據(jù)庫驗證AD信號通路靶點(diǎn)變化

AlzData數(shù)據(jù)庫［18］（http://www.alzdata.org/）對 684例AD病人以及562例對照腦組織基因表達(dá)譜進(jìn)行了整合分析，我們使用該數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵信號通路的靶點(diǎn)在AD病人中的變化情況。

1.7 分子對接驗證核心靶點(diǎn)

將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名最高的10個靶點(diǎn)視為核心靶點(diǎn)，使用對接網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器SwissDock（http://www.swissdock.ch/docking）對RES與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，以驗證其與核心靶點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)度。使用PubChem數(shù)據(jù)庫查找RES三維結(jié)構(gòu)，保存為SDF格式，使用OpenBabel軟件轉(zhuǎn)換為Mol2格式，進(jìn)一步使用UCSF Chimera軟件添加氫原子。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）查找核心靶點(diǎn)，使用UCSF Chimera軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)文件預(yù)處理。點(diǎn)擊Tools-＞Structure Editing-＞Dock Prep，在彈出窗口中不選擇Write Mol2 file。在Add Hydrogen for Dock Prep窗口保留默認(rèn)設(shè)置，完成后保存為pdb格式文件。在SwissDock網(wǎng)站分別上傳RES配體與靶蛋白進(jìn)行分子對接。

1.8 藥品及試劑

RES（SRT501，MCE公司），CCK-8試劑盒（B34302）（Bimake生物科技有限公司）。二甲基亞砜(DMSO)、DMEM培養(yǎng)基（美國Sigma）。pS396（p-Tau at Ser396）（美國Biosource），Tau5（總Tau）（美國Millipore），Tau1（Ser-198/199/202位點(diǎn)非磷酸化Tau）（美國Chemicon），pS199（p-Tau at Ser199）（美國 Invitrogen），GSK3β（總GSK3β）和p-GSK3β（p-GSK3β at Ser9）（Cell Signaling technology），CDK5 與 p-CDK5（Tyr15）（Santa Cruz Biotechnology），GAPDH（英國Abcam）。

1.9 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

細(xì)胞模型是研究AD的有效方法之一，本研究選用過表達(dá)人Tau的AD細(xì)胞模型。人胚腎細(xì)胞293細(xì)胞（293WT）與穩(wěn)轉(zhuǎn)人野生型Tau的293細(xì)胞（293Tau）來自本實驗室。細(xì)胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。RES使用DMSO配置成100 mmol/L母液待用。293Tau細(xì)胞種植于96孔板，密度為20×104，24 h后分別給與0、25、50、75、100 μmol/L RES 處理 6 h，由此確定 RES 處理293Tau細(xì)胞的最佳濃度。進(jìn)一步使用最佳濃度處理0、6、12、24、36 h確定RES處理時間。293Tau細(xì)胞分為3組，分別為293Tau、293Tau+DMSO（溶劑對照）、293Tau+RES，觀察RES對Tau磷酸化的影響。

1.10 CCK-8活性檢測

嚴(yán)格根據(jù)CCK-8試劑盒使用說明書檢測CCK-8活性，用BioTek酶標(biāo)儀（BioTek Laboratory Instruments，美國）檢測在450nm處的吸光度值A(chǔ)450nm。

1.11 蛋白免疫印跡檢測

1.11.1 細(xì)胞樣品 吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS溶液清洗殘留培養(yǎng)基和死亡脫落細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞密度每孔加入100～200μL細(xì)胞裂解液，將裂解液收集到EP管中。100℃沸水中煮沸10 min，然后在冰中超聲5 s。離心15 min（4℃，轉(zhuǎn)速14 000 g），吸取上清液并進(jìn)行分裝。測完蛋白濃度后按比例加入溴酚藍(lán)（終濃度0.2%）和β-巰基乙醇（終濃度10%），-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11.2 Western blotting 根據(jù)測得的蛋白質(zhì)濃度，計算出各樣品的上樣量。常規(guī)電泳和轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂牛奶封閉 NC 膜，加抗 p-S396-Tau，p-S199-Tau，Tau5，GSK3β，p-GSK3β等一抗4℃孵育過夜。次日用TBSTween-20洗滌NC膜后，二抗（IRDye@800CW，1∶10 000）孵育1 h（室溫避光）。再用TBS-Tween-20洗滌后，Odyssey紅外掃描儀（Li-Cor biosciences，美國）掃描，用ImageJ統(tǒng)計軟件（NIH,Bethesda,MD,USA）進(jìn)行灰度值統(tǒng)計分析。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0版軟件錄入數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。3組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey多重比較檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RES、AD靶點(diǎn)的獲取

SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫與BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中獲得RES作用靶點(diǎn)分別為87、100個，去重后得到182個作用靶點(diǎn)。以“Alzheimer's disease”為疾病關(guān)鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫、AD數(shù)據(jù)庫以及TTD數(shù)據(jù)庫分別檢索到100、320、143個AD相關(guān)靶點(diǎn)，去重后得到525個AD靶點(diǎn)。

2.2 RES治療AD PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

182個RES作用靶點(diǎn)與525個AD相關(guān)靶點(diǎn)使用Venny 2.1求交集，獲得RES治療AD的靶點(diǎn)36個（圖1A）。RES治療AD的36個靶點(diǎn)具體為：ADAM17、ADRA2C、 ADRB2、 AHR、 APP、 CACNA1C、CACNA1D、CDK1、CDK5、CHRNA7、ESR1、ESR2、FGFR2、GSK3A、GSK3B、IGF1R、INS、INSR、KIT、LCK、MAOA、MAPT、MME、MMP1、MMP2、MMP9、NOS1、NQO2、PDE4D、SLC6A4、TGFB1、TTR、UCHL1、VCP、VDR與WEE1（表1）。使用Panther數(shù)據(jù)庫將RES治療AD 36個靶點(diǎn)分為8類，前4的功能為：蛋白質(zhì)修飾酶（34.6%）、代謝物相互轉(zhuǎn)化酶（27.7%）、基因特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（13.8%）、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（10.3%）（圖1B）。蛋白質(zhì)修飾酶中CDK1、CDK5、GSK3A、GSK3B與WEE1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MME、MMP1、MMP2、MMP9為金屬蛋白酶。

表1 RES治療AD靶點(diǎn)Tab.1 Target proteins of RES against AD

圖1 RES作用靶點(diǎn)與AD靶點(diǎn)交集及功能分類Fig.1 Intersection and functional classification of RES and AD targets.A:The Venn diagram was applied to obtain the intersection of the RES and AD target.B:Panther classification categorized target proteins of RES against AD.The percentages of the proteins in their functional class are shown in the pie chart.

將RES治療AD的36個靶蛋白導(dǎo)入String 11.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析，得到RES治療AD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)共有36個節(jié)點(diǎn)，125條邊，平均度值為6.94，其中NQO2未與其他靶點(diǎn)發(fā)生相互作用。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，使用Cytohubba插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯?jié)點(diǎn)顏色越深度值越高，即與更多的節(jié)點(diǎn)發(fā)生相互作用。結(jié)果顯示，RES治療AD度值排名前10的依次為INS、APP、ESR1、MMP9、IGF1R、CACNA1C、MAPT、MMP2、TGFB1與GSK3B（圖3），其中INS度值高達(dá)27。

圖2 RES治療AD靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of the targets of RES for treatment of AD.

圖3 RES治療AD靶點(diǎn)拓?fù)浞治鯢ig.3 Topological analyses of the targets of RES for treatment of AD.The nodes represent the target proteins and the edges represent the interaction among the targets.A redder color indicates a higher degree of interaction.

2.3 GO生物學(xué)過程與KEGG通路富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對RES治療AD的36個靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)過程與KEGG通路富集分析。GO生物學(xué)過程前20條富集信息（圖4），X軸代表富集因子，Y軸代表GO生物學(xué)過程名稱，氣泡大小代表GO生物學(xué)過程中的靶點(diǎn)數(shù)量，氣泡顏色為-log10(p value)代表富集顯著性。GO生物學(xué)過程主要涉及對β-淀粉樣蛋白的反應(yīng)、轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)節(jié)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、行為、學(xué)習(xí)或記憶、老化、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控等（圖4）。

圖4 GO富集分析生物學(xué)過程Top20氣泡圖Fig.4 Top 20 bubble chart of biological process of GO enrichment analysis.The X-axis represents the enrichment factor,the bubble size represents the count of targets enriched in terms and the color represents the Pvalue.

KEGG通路富集主要涉及阿爾茨海默病、內(nèi)吞作用、cGMP-PKG信號通路、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、鈣信號通路、MAPK信號通路、GnRH信號通路、膽堿能突觸、雌激素信號途徑、PI3K-Akt信號通路、AMPK信號通路等（圖5）。KEGG富集分析信號通路詳細(xì)信息見表2。

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble chart of KEGG pathway enrichment analysis.The X-axis represents the enrichment factor,bubble size represents the count of targets enriched in terms and the color represents the Pvalue.

表2 RES治療AD KEGG通路富集分析Tab.2 KEGG pathway enrichment analysis of RES against AD

為更直觀的顯示參與RES治療AD涉及KEGG通路所涉及的靶點(diǎn)，進(jìn)一步使用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建了“靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖6）。“靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖中共有45個節(jié)點(diǎn)，73條邊，平均度值為3.24。KEGG通路阿爾茨海默病通路度值最高為9，其次為PI3K-Akt信號通路、cGMP-PKG信號通路、MAPK信號通路等。

圖6 RES治療AD“靶點(diǎn)-信號通路”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Target-signaling pathway network diagram of RES for treatment of AD.Green nodes represent the target proteins and purple diamond nodes represent the enriched KEGG pathway.

進(jìn)一步使用AlzData數(shù)據(jù)庫檢索富集最顯著、度值最高的阿爾茨海默病（hsa05010）信號通路相關(guān)靶點(diǎn)在AD病人顳葉皮層中的變化情況，結(jié)果顯示參與該通路的APP、CDK5與GSK3B在AD病人中均顯著下調(diào)（圖7）。本研究繪制了參與阿爾茨海默病信號通路的9個靶點(diǎn)在KEGG通路圖中的具體位置，參與靶點(diǎn)顯示為紅色（圖8）。

圖7 AD病人中參與阿爾茨海默病信號通路蛋白變化Fig.7 Changes in proteins involved in Alzheimer's disease signaling pathway in AD patients.APP:Amyloid beta precursor protein;CDK5:Cyclin dependent kinase 5;GSK3B:Glycogen synthase kinase 3 beta.

圖8 RES調(diào)控阿爾茨海默病信號通路靶點(diǎn)（紅色標(biāo)示）Fig.8 Targets(red)regulated by RES in Alzheimer's disease signaling.

2.4 RES-核心靶點(diǎn)分子對接

使用SwissDock驗證RES與核心靶點(diǎn)的結(jié)合，選擇G最低的對接模型。Delta G數(shù)值負(fù)數(shù)為結(jié)合后可釋放的自由能，其絕對值越大、結(jié)合越穩(wěn)定。RES與ESR1、GSK3B、MMP9、IGF1R、APP與INS分子對接結(jié)果（表3）。對接結(jié)果顯示RES與核心靶點(diǎn)均有較強(qiáng)的相互作用，其中RES與ESR1的Delta G數(shù)值最低為-8.27kcal/mol，RES與GSK3B的Delta G為-7.71kcal/mol。

表3 RES-核心靶點(diǎn)分子對接Tab.3 Molecular docking of the core target proteins with RES

2.5 不同RES濃度及時間對293Tau細(xì)胞的影響

本研究采用過表達(dá)人Tau的AD細(xì)胞模型（293Tau細(xì)胞），相比293Tau細(xì)胞293 WT不表達(dá)人Tau（圖9A）。為確定RES處理細(xì)胞最佳濃度，分別使用0、25、50、75、100 μmol/L RES處理293Tau細(xì)胞6 h。CCK-8結(jié)果顯示，75與100 μmol/LRES會降低細(xì)胞存活率，即50μmol/L是RES處理293Tau細(xì)胞的最佳濃度（圖9B）。進(jìn)一步使用50 μmol/L RES處理293Tau細(xì)胞0、6、12、24、36 h，結(jié)果顯示，RES處理293Tau細(xì)胞24、36 h可明顯降低細(xì)胞存活率，因此50 μmol/L、12 h是RES處理293Tau細(xì)胞的最佳濃度和時間（圖9C）。

圖9 不同RES濃度及時間對293Tau細(xì)胞的影響Fig.9 Dose-and time-dependent effects of RES on 293Tau cells.A:Levels of Tau5(total Tau)and Tau1(nonphosphorylated Tau at Ser-198/199/202)measured by Western blotting;B:Relative cell viabilities of 293Tau cells after treatment with different concentration of RES for 6 h determined by cell counting kit-8(CCK8)assay(n=6);C:Relative cell viabilities of 293Tau cells treated with 50 μmol/L RES for 0-36 h shown by CCK8 assay(n=3).Data are presented as Means±SD.*P＜0.05,***P＜0.001vs0μmol/Lor0h.

2.6 RES通過調(diào)控GSK3β降低293Tau細(xì)胞Tau蛋白磷酸化

50 μmol/LRES處理12 h后檢測各組Tau蛋白磷酸化水平、GSK3β活性。免疫印跡結(jié)果顯示，RES處理可顯著降低293Tau pS396和pS199水平，明顯升高p-GSK3β（非激活型GSK3β）水平。RES處理293Tau細(xì)胞并不影響各組間總的CDK5水平，但可以顯著降低CDK5酪氨酸15位點(diǎn)磷酸化水平（圖10）。

圖10 RES降低293Tau細(xì)胞Tau磷酸化水平Fig.10 RES reduces tau phosphorylation level in 293Tau cells.A,B:Levels of Tau5(total Tau),pS199(p-Tau at Ser199)and pS396(p-Tau at Ser396)measured by Western blotting and quantitative analysis(n=3);C,D:Levels of total GSK3β (t-GSK3β)and p-GSK3β (p-GSK3β at Ser9)measured by Western blotting(n=3).E,F:Levels of CDK5 and p-CDK5(p-CDK5 at Tyr15)measured by Western blotting(n=3).Data are presented asMean±SD.*P＜0.05,***P＜0.001.

3 討論

RES是一種神經(jīng)保護(hù)特性的多酚化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌和抗淀粉樣蛋白等作用［19-20］，在體內(nèi)和體外的實驗中具有抗AD的作用［21-22］。本研究獲得36個RES治療AD的靶點(diǎn)，其中ADRB2、CDK5、GSK3A、GSK3B、LCK、MAPT（微管相關(guān)蛋白 Tau）、MME、MMP2、TGFB1、VDR與AD Tau病理學(xué)變化顯著相關(guān)，ADAM17、ADRB2、CACNA1C、CDK5、GSK3A、GSK3B、MMP2、PDE4D、TGFB1、UCHL1、VCP與Aβ病理學(xué)變化顯著相關(guān)，其中ADRB2、CDK5、GSK3A、GSK3B、MMP2、TGFB1與Aβ、Tau病理過程均顯著相關(guān)［18］。研究表明姜黃素可以通過阻礙大鼠CDK5的激活降低Aβ聚集與Tau過度磷酸化從而改善AD［23］。本研究在AD細(xì)胞模型（293Tau細(xì)胞）中發(fā)現(xiàn)RES處理可以抑制CDK5的激活。此外，蛋白功能分類表明MME、MMP1、MMP2、MMP9為金屬蛋白酶，其中MMP2與MMP9可降解Aβ且在AD腦中的表達(dá)增加［24］。

GO富集分析結(jié)果表明，RES治療AD的靶點(diǎn)富集最顯著的生物學(xué)過程是β-淀粉樣蛋白的反應(yīng)，此外富集生物學(xué)過程還涉及轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)節(jié)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、行為、學(xué)習(xí)或記憶、老化等。RES治療AD靶蛋白KEGG通路主要富集在阿爾茨海默病、內(nèi)吞作用、cGMP-PKG信號通路、5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、鈣信號通路、MAPK信號通路、GnRH信號通路、膽堿能突觸、雌激素信號途徑、PI3K-Akt信號通路、AMPK信號通路等。研究表明RES可抗氧化、抑制乙酰膽堿酯酶活力和抗凋亡，對老年性癡呆小鼠認(rèn)知功能具有一定保護(hù)作用［8］，同時有效地逆轉(zhuǎn)Aβ25-35導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶的損傷［25］，減少了淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）的淀粉樣蛋白裂解，增強(qiáng)了淀粉樣β肽的清除率，抑制淀粉樣蛋白生成途徑并刺激自噬等過程降解Aβ聚集，補(bǔ)充RES有利于Tau蛋白的去磷酸化并抑制其聚集［26-27］。這說明RES可以通過影響AD病理改變的方式例如Aβ、Tau、膽堿能突觸等治療AD。

RES治療AD的36個靶點(diǎn)可形成復(fù)雜的PPI網(wǎng)絡(luò)，其中 INS、APP、ESR1、MMP9、IGF1R、CACNA1C、MAPT、MMP2、TGFB1與GSK3B是RES治療AD的核心靶點(diǎn)。淀粉樣前體蛋白APP一種在全身細(xì)胞中廣泛表達(dá)的蛋白質(zhì)，其突變可導(dǎo)致早發(fā)性AD［28］。APP被剪切后可形成Aβ，Aβ在細(xì)胞外沉淀聚積后具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用。GSK3B在腦內(nèi)神經(jīng)元高表達(dá)，是Tau蛋白磷酸化過程中關(guān)鍵激酶，不僅可以影響Tau蛋白磷酸化還可以影響Aβ的形成［29］。有研究報道m(xù)iR-137調(diào)控CACNA1C參與了AD的發(fā)生［30］。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的功能是使蛋白質(zhì)上的絲氨酸和蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化，蛋白功能分類顯示CDK1、CDK5、GSK3A、GSK3B、WEE1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。分子對接結(jié)果顯示RES與GSK3B有較強(qiáng)的結(jié)合作用。本研究在AD細(xì)胞模型（293Tau細(xì)胞）中發(fā)現(xiàn)50 μmol/LRES處理12 h可顯著降低Tau蛋白磷酸化水平，進(jìn)一步檢測Tau蛋白磷酸化過程中關(guān)鍵激酶GSK3β（GSK3B），發(fā)現(xiàn)RES處理可明顯升高p-GSK3β水平。以上結(jié)果提示，RES可以通過調(diào)控GSK3β改善AD病理改變。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)分析明確了RES治療AD的核心靶點(diǎn)，通過GO富集分析與KEGG通路分析闡釋其關(guān)鍵信號通路及分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)RES可以通過AD Aβ、Tau病理過程改善AD。使用分子對接技術(shù)對RES與核心靶點(diǎn)的結(jié)合進(jìn)行了驗證，并在AD細(xì)胞模型中驗證了RES可通過調(diào)控CDK5與GSK3β改善AD病理改變。本研究可為RES治療AD的臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)，為后續(xù)機(jī)制研究提供思路和方法。