【摘 ? 要】 ? 傳統(tǒng)發(fā)酵食品檢驗(yàn)方法因受到死菌細(xì)胞和雜質(zhì)顆粒的影響，導(dǎo)致檢驗(yàn)穩(wěn)定性不高。因?yàn)?，利用消除法處理活菌圖像中的黑色連通區(qū)域，去除雜質(zhì)顆粒，通過(guò)檢測(cè)空心去除死菌細(xì)胞。根據(jù)處理后的活菌圖像提取活菌特征參數(shù)，將提取到的參數(shù)輸入到BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，得到發(fā)酵產(chǎn)物微生物檢驗(yàn)結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，利用模糊控制技術(shù)設(shè)計(jì)反饋控制，通過(guò)溫度參數(shù)的反饋實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵食品微生物的質(zhì)量控制。結(jié)果表明，研究的發(fā)酵食品微生物檢驗(yàn)方法靈敏度高，精密度滿足檢驗(yàn)需求，且穩(wěn)定性得到了提升。

【關(guān)鍵詞】 ? 發(fā)酵食品;微生物檢驗(yàn);質(zhì)量控制;食品安全;模糊控制

Research on Microbiological Inspection Methods and Quality

Control of Fermented Food

Chi Yufen

（Fuzhou Liming Vocational and Technical College，F(xiàn)uzhou 350109，China）

【Abstract】Due to the influence of dead cells and impurity particles， the traditional inspection methods of fermented food are not stable. The black connected area in the live bacteria image is processed by the elimination method to remove the impurity particles. The dead bacteria cells are removed by detecting the hollow. The characteristic parameters of the live bacteria are extracted according to the processed live bacteria image. The extracted parameters are input into the BP neural network to obtain the microbiological test results of the fermentation products. On this basis， fuzzy control technology is used to design feedback control， through the feedback of temperature parameters to achieve the quality control of fermented food microorganisms. The results showed that the microbial detection method of fermented food had high sensitivity， precision and stability.

【Key words】fermented food; microbiological examination; quality control; food safety; fuzzy control

〔中圖分類號(hào)〕 TS207.4 ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕 ?A ? ? ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕 1674 - 3229（2021）03- 0000 - 00

0 ? ? 引言

發(fā)酵食品主要通過(guò)微生物作用制取獲得，該類食品發(fā)展到現(xiàn)在適應(yīng)范圍已經(jīng)非常廣泛，是目前食品工業(yè)中重要分支[1]。隨著發(fā)酵食品的發(fā)展，在給食品工業(yè)添加色彩的同時(shí)，也帶來(lái)了一些安全問(wèn)題[2]。由于發(fā)酵工藝本身使用的微生物來(lái)源比較廣泛，在培養(yǎng)過(guò)程中容易受到污染，菌群形成也比較復(fù)雜，很難控制，發(fā)酵過(guò)程中容易混有有害菌株，導(dǎo)致在發(fā)酵食品中存在一些有害的代謝產(chǎn)物;另外，在發(fā)酵過(guò)程中如果對(duì)雜菌含量控制不當(dāng)，也會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)基或反應(yīng)過(guò)程中含有有害菌，影響發(fā)酵食品質(zhì)量[3-5]。對(duì)于這種情況，發(fā)酵食品的微生物在線檢驗(yàn)受到越來(lái)越多的重視。

現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有了一些自動(dòng)的微生物分析技術(shù)問(wèn)世，如基于高通量測(cè)序的檢驗(yàn)方法和基于擴(kuò)增子測(cè)序的檢驗(yàn)方法，但以上兩種方法受到死菌細(xì)胞和雜質(zhì)顆粒的影響，對(duì)于活菌的檢驗(yàn)存在靈敏度低，精密度不高的情況[6-8]。因此，提出一種新的發(fā)酵食品微生物檢驗(yàn)方法，同時(shí)研究其質(zhì)量控制，解決傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法中存在問(wèn)題，為發(fā)酵食品的安全發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1 ? ? 發(fā)酵食品微生物檢驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

1.1 ? 提取活菌圖像特征參數(shù)

在提取活菌圖像特征參數(shù)之前，采用中速定量濾紙去掉絕大部分的雜質(zhì)顆粒，但是處理完成后在活菌圖像中還是存在一部分雜質(zhì)顆粒[9]。因此，在提取活菌圖像中的特征參數(shù)之前，需要采取一定的手段將非菌體的部分剔除掉?？紤]到絕大多數(shù)的活菌體內(nèi)部存在空心這一特點(diǎn)，采用大區(qū)域消除法去除掉黑色連通區(qū)域面積過(guò)大的雜質(zhì)顆粒，將連通區(qū)域中的所有像素值置為白色，消除該區(qū)域。并且在消除完成后，通過(guò)掃描空心去除死菌影響[10]。

掃描去除黑色連通區(qū)域的活菌圖像，假設(shè)剩余連通區(qū)域的[X]軸和[Y]軸坐標(biāo)的最大值分別為[Xmax]、[Ymax]，最小值為[Xmin]、[Ymin]，利用公式計(jì)算出中心點(diǎn)坐標(biāo)，計(jì)算公式如下：

[Ox=Xmax-Xmin2Oy=Ymax-Ymin2] （1）

通過(guò)計(jì)算的中心坐標(biāo)，結(jié)合周圍八個(gè)方向點(diǎn)的像素值之和，判斷出該連通區(qū)域是否為空心。如果以上9個(gè)點(diǎn)之和不為零，說(shuō)明該連通區(qū)域是空心的，反之，則是實(shí)心區(qū)域。當(dāng)判斷出連通區(qū)域?yàn)閷?shí)心區(qū)域，則將該區(qū)域所有像素值置為白色，消除該區(qū)域，去除死菌影響。消除結(jié)果如圖1所示。

為了更準(zhǔn)確地提取出活菌圖像中的特征參數(shù)，對(duì)二值圖像掃描，找到第一像素值為0的點(diǎn)，以該點(diǎn)為起始點(diǎn)進(jìn)行順時(shí)針輪廓跟蹤，直到回到起始點(diǎn)，此時(shí)跟蹤結(jié)束[11]。將跟蹤后形成的區(qū)域填充為灰色，完成單個(gè)菌體細(xì)胞的空洞填充，待掃描完成后，將所有灰色區(qū)域填充為黑色。

利用公式計(jì)算出利用鏈碼進(jìn)行跟蹤時(shí)的菌體面積，計(jì)算公式如下：

[S0=i=1nκixyi-1+12κiy] （2）

公式中[n]表示鏈碼總數(shù)，[i]表示8個(gè)方向，[y]表示縱坐標(biāo)，[κiy]表示縱坐標(biāo)上對(duì)應(yīng)點(diǎn)的坐標(biāo)，如圖2所示。

完成填充后，提取活菌圖像中的特征參數(shù)。根據(jù)微生物細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征，提取的參數(shù)特征包括菌體區(qū)域面積、菌體邊界長(zhǎng)度、形狀因子和偏心率[12]。其中菌體區(qū)域面積計(jì)算公式如公式（2）所示。菌體邊界長(zhǎng)度是鏈碼所圍細(xì)菌細(xì)胞區(qū)域的周長(zhǎng)，上述中鏈路為8連通區(qū)域，在此情況下，默認(rèn)垂直和水平的步幅為1，則其對(duì)角幅為[2]，則周長(zhǎng)[L]計(jì)算公式為：

[L=nr+nu2] （3）

公式中，[n]表示鏈碼的偶數(shù)碼的數(shù)目，[u]表示鏈碼中的奇數(shù)碼的數(shù)目。在所有特征參數(shù)中，形狀因子主要用來(lái)描述菌體細(xì)胞區(qū)域與圓形偏離、以及菌體表面褶皺的程度[13]。該特征參數(shù)計(jì)算公式如下：

[G=L24πS0] （4）

當(dāng)活菌體呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)形狀時(shí)，計(jì)算出的[G]值為1，當(dāng)菌體形狀與標(biāo)準(zhǔn)形狀偏離得越嚴(yán)重，形狀因子[G]偏離1越遠(yuǎn)。計(jì)算特征參數(shù)中的偏心率，需要先計(jì)算出長(zhǎng)軸長(zhǎng)和短軸長(zhǎng)[14]。計(jì)算公式如下：

[Pw=maxv=1iκvx+x0-minv=1iκvx+x0Ph=maxv=1iκvy+y0-minv=1iκvy+y0] （5）

公式中，[κv]表示活菌圖像上的任意一點(diǎn)，[κvx]表示橫坐標(biāo)上的分量，[κvy]表示縱坐標(biāo)上的分量，[x0]與[y0]表示起始點(diǎn)的坐標(biāo)。則長(zhǎng)軸長(zhǎng)和短軸長(zhǎng)分別為：

[fc=maxPw，Phfi=minPw，Ph] （6）

偏心率計(jì)算公式為：

[η=fcfi] （7）

公式中，[fc]表示區(qū)域長(zhǎng)軸，[fi]表示區(qū)域短軸，在實(shí)際計(jì)算中偏心率的值會(huì)略大于實(shí)際值，這是因?yàn)榛罹鷪D像數(shù)字化會(huì)產(chǎn)生邊角效應(yīng)[15]。通過(guò)以上過(guò)程區(qū)分出菌體細(xì)胞和雜質(zhì)顆粒，從中提取出能夠描述細(xì)菌的形狀特征作為微生物檢驗(yàn)參數(shù)，以便用于后續(xù)的微生物檢驗(yàn)。

1.2 ? 檢驗(yàn)分類器設(shè)計(jì)

以提取出的特征參數(shù)作為輸入，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵食品微生物檢驗(yàn)。設(shè)計(jì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)時(shí)，以提取的特征參數(shù)作為輸入層的神經(jīng)元，輸出層包含一個(gè)神經(jīng)元，設(shè)置細(xì)菌的導(dǎo)師信號(hào)是0.9，非細(xì)菌的導(dǎo)師信號(hào)為0.1。隱含層中的神經(jīng)元數(shù)通過(guò)計(jì)算獲得：

[n1=β+ω+α] （8）

公式中，[β]表示輸出神經(jīng)元數(shù)，[ω]表示輸入神經(jīng)元數(shù)，[α]表示常數(shù)，[α∈1，10]。使用雙曲正切[S]型函數(shù)將神經(jīng)元的輸入范圍為[-∞，+∞]映射到[-1，1]，當(dāng)各個(gè)神經(jīng)元采用[S]型函數(shù)時(shí)，使用兩個(gè)隱含層即可實(shí)現(xiàn)任意輸入的任意函數(shù)，檢驗(yàn)出發(fā)酵食品中各類微生物。[S]型函數(shù)表示為：

[Sx=11+e-x] （9）

將提取的特征參數(shù)輸入到設(shè)計(jì)的BP網(wǎng)絡(luò)中后，采用[S]型函數(shù)，使用任意兩個(gè)隱含層即可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵食品微生物的檢驗(yàn)。

2 ? ? 發(fā)酵食品微生物質(zhì)量控制設(shè)計(jì)

發(fā)酵食品微生物質(zhì)量與發(fā)酵溫度息息相關(guān)，微生物發(fā)酵過(guò)程中主要分為菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物生產(chǎn)兩個(gè)階段，只有在最優(yōu)溫度的環(huán)境條件下，使微生物質(zhì)量符合最優(yōu)溫度條件，才能得到最佳產(chǎn)物。

在發(fā)酵食品微生物質(zhì)量控制中，采用模糊控制，以溫度作為反饋參數(shù)，通過(guò)溫度的反饋控制質(zhì)量的變化。溫度的控制則通過(guò)調(diào)節(jié)冷卻水流量來(lái)實(shí)現(xiàn)。模糊控制結(jié)構(gòu)如圖3所示。

在發(fā)酵食品微生物質(zhì)量控制過(guò)程中，首先設(shè)定一個(gè)溫差閾值[T']，通過(guò)比較實(shí)際溫差絕對(duì)值與溫差閾值實(shí)現(xiàn)控制。當(dāng)[T>T']時(shí)，采用模糊控制加快響應(yīng)速度，調(diào)節(jié)環(huán)境溫度;當(dāng)[T=T']時(shí)，采用控制器實(shí)現(xiàn)反饋，控制微生物質(zhì)量。

3 ? ? 發(fā)酵食品微生物檢驗(yàn)方法及質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)研究

3.1 ? 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備

發(fā)酵食品種類比較多，在實(shí)驗(yàn)研究中選擇一種比較典型的蔬菜發(fā)酵制品酸菜作為研究目標(biāo)，酸菜主要以大白菜為原料，利用天然的微生物進(jìn)行乳酸發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中，微生物群落不斷變化，情況比較復(fù)雜。因此，使用酸菜作為實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，對(duì)不同檢驗(yàn)方法的對(duì)比分析具有重要意義。使用不同的微生物檢驗(yàn)方法在相同的實(shí)驗(yàn)條件下分析其靈敏度以及精密度。實(shí)驗(yàn)中使用的試劑如表1所示。

實(shí)驗(yàn)中使用的設(shè)備有生物傳感器、電熱手提式壓力蒸汽消毒器、電子天平、生化培養(yǎng)箱、pH計(jì)、離心機(jī)、熒光定量PCR儀以及分光光度計(jì)。

3.2 ? 細(xì)菌培養(yǎng)及材料制備

準(zhǔn)備液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，使用酵母、NaCl和胰蛋白胨溶于去離子水中，待粉末完全溶解后，使用NaOH溶液調(diào)整pH值到7.4，制成液體培養(yǎng)基，待滅菌操作后，放入無(wú)菌操作臺(tái)待用。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入瓊脂粉，高壓滅菌后備用。

在實(shí)驗(yàn)之前，取出一定量的液體培養(yǎng)基，在無(wú)菌操作臺(tái)上接入大腸桿菌菌種，將其放入搖床中，設(shè)置好轉(zhuǎn)速與溫度，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的處理，得到飽和的菌懸液;選取一定量的酸菜發(fā)酵液，通過(guò)過(guò)濾去除掉液體中的雜質(zhì)，得到無(wú)雜質(zhì)的濾液，經(jīng)過(guò)高壓滅菌后，將菌懸液注入到滅菌酸菜液中，混合搖勻后，得到實(shí)驗(yàn)樣品，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將其分組，其中一組用于驗(yàn)證，另外三組用于檢驗(yàn)。

3.3 ? 靈敏度實(shí)驗(yàn)及分析

采用熒光定量分析方法進(jìn)行檢驗(yàn)，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果的吸收峰圖譜，分析不同檢驗(yàn)方法的靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所示。

對(duì)比觀察圖中結(jié)果可知，圖a中顯示五種菌株反應(yīng)基本相同，沒(méi)有檢驗(yàn)出發(fā)酵乳酸產(chǎn)物，其靈敏度差;相比之下，圖b中菌株05的檢出限得到了提高，但是依然沒(méi)有檢驗(yàn)出發(fā)酵乳酸產(chǎn)物，其靈敏度較高;圖c中顯示五種菌株中只有菌株05出現(xiàn)陽(yáng)性吸收峰，菌株05對(duì)發(fā)酵乳酸才有產(chǎn)物生產(chǎn)，其靈敏度更高。這說(shuō)明所提發(fā)酵食品微生物檢驗(yàn)方法在檢驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有受到死菌細(xì)胞和雜質(zhì)顆粒的影響，在實(shí)驗(yàn)樣品中準(zhǔn)確地檢驗(yàn)出了發(fā)酵乳酸產(chǎn)物。

3.4 ? 精密度實(shí)驗(yàn)及分析

精密度實(shí)驗(yàn)主要根據(jù)不同檢驗(yàn)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品中不同菌種的檢出率，計(jì)算出回歸方程，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的回歸方程和相關(guān)參數(shù)分析不同檢驗(yàn)方法的精密度。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

從表中結(jié)果可以看出，傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法中不同菌種的峰面積跨度比較大，RSD值也比較高，說(shuō)明兩種檢驗(yàn)方法精密度不夠;而設(shè)計(jì)的檢驗(yàn)方法不同菌種之間峰面積相差不大，并且RSD值比較低，說(shuō)明該方法的精密度比較高。結(jié)合靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，所提發(fā)酵食品微生物檢驗(yàn)方法的靈敏度高，精密度能夠滿足檢驗(yàn)需求，說(shuō)明所提方法優(yōu)于傳統(tǒng)的發(fā)酵食品微生物檢驗(yàn)方法。

4 ? ? 結(jié)語(yǔ)

食品微生物發(fā)酵是一個(gè)比較復(fù)雜的過(guò)程，具有較高的不確定性，研究發(fā)酵食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法及其質(zhì)量控制可以在很大程度上保證食品安全。本文針對(duì)傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法中的問(wèn)題，設(shè)計(jì)具有針對(duì)性的處理方法，以達(dá)到解決相關(guān)問(wèn)題的目的。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明了提出的方法的穩(wěn)定可靠。但是研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題，提出的檢驗(yàn)方法自動(dòng)化程序不夠高效，需要消耗一定的人力資源成本，在后續(xù)的研究中可從這一方面進(jìn)行深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 郭紅珍，閆訓(xùn)友，史振霞，等. “以問(wèn)題為導(dǎo)向”的食品感官鑒定教學(xué)改革探討[J]. 廊坊師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，20（4）：114-115+125.

[2] 劉平平，虞旦，王昌濤，等. 三七多糖的微生物發(fā)酵提取工藝優(yōu)化及其抗炎功效評(píng)價(jià)[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2019，40（18）：71-78+83.

[3] 李珊珊，祝超智，崔文明，等. 發(fā)酵肉制品中微生物發(fā)酵劑分離篩選及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 肉類研究，2019，33（7），61-66.

[4] 曲勤鳳，徐瓊，張娜娜，等. 微生物法測(cè)定發(fā)酵食品中維生素B_（12）含量的研究[J]. 中國(guó)釀造，2019， 38（6）：181-184.

[5] 王興潔，劉愛(ài)平，敖曉琳，等. 中國(guó)傳統(tǒng)食醋微生物污染及控制措施研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2019，45（10）：260-265.

[6] 劉筱雪，袁文娟，丁濤，等. 基于高通量測(cè)序?qū)λ拇☉堰h(yuǎn)特色發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)分析[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019，56（3）：537-543.

[7] 孫善峰，黃曉寧，韓北忠，等. 擴(kuò)增子測(cè)序分析助力傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落研究[J]. 中國(guó)釀造，2019，38（5）：1-5.

[8] 張書(shū)泰，周斌，童星，等. 醬油釀造過(guò)程中微生物多樣性分析方法研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)調(diào)味品，2019，44（2）：193-200.

[9] 田露，閔建紅，張帝，等. 宏組學(xué)在發(fā)酵食品微生物群落研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2019，35（4）：116-124.

[10] 代云桃，靳如娜，孫蓉，等.中藥保健食品的質(zhì)量控制現(xiàn)狀和研究策略[J].中國(guó)中藥雜志，2019， 44（5）：880-884.

[11] 范迪，張寧，楊燕，等. 食品中肌醇的微生物檢測(cè)方法研究[J]. 食品工業(yè)科技，2019，40（16）：192-195+200.

[12] 廖曉林. 醫(yī)院微生物檢驗(yàn)標(biāo)本不合格原因分析及質(zhì)量控制對(duì)策探討[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2018，45（20）：3785-3788.

[13] 張娟，嚴(yán)家俊，吳風(fēng)霞，等. 食品中維生素B_（12）和葉酸微生物檢測(cè)法的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2018，39（24）：346-349.

[14] 曹利瑞，熊智強(qiáng)，朱松，等. 黃酒釀造過(guò)程中產(chǎn)生物胺菌株的篩選及其特性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2018，18（6）：68-75.

[15] 鄧建陽(yáng)，李浩，蔣雪薇，等. 食用檳榔加工工藝及其化學(xué)與微生物污染研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械，2018，34（1）：173-176.

[收稿日期] ? 2021-02-12

[基金項(xiàng)目] ? 2019年福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目“基于高職藥物制劑技術(shù)專業(yè)的就業(yè)情況調(diào)查與人才培養(yǎng)的研究”（JAS19743）

[作者簡(jiǎn)介] ? 池玉芬（1985- ），女，碩士， 福州黎明職業(yè)技術(shù)學(xué)院講師，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與檢測(cè)。