沈珊珊，蔣廷頁(yè)，楊天宇，鈕 慧，張永勝，曹志飛，蔡為民

胰腺癌是預(yù)后較差的惡性腫瘤之一，5年生存率為5%～8%，其發(fā)生、發(fā)展在分子水平上具有高度的異質(zhì)性[1-2]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，學(xué)者們對(duì)胰腺癌的基因特點(diǎn)有了更深入的認(rèn)識(shí)，但缺乏早期發(fā)現(xiàn)和有效干預(yù)仍然是胰腺癌患者預(yù)后差和生存率低下的主要原因[3]。GRP78是一種普遍表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的伴侶蛋白，已有多項(xiàng)研究表明其在胃癌、肝細(xì)胞肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中過(guò)度表達(dá)，并且與患者預(yù)后不良有關(guān)，其機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移以及抑制腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[4-5]。目前，GRP78在胰腺癌中表達(dá)的相關(guān)報(bào)道較少[6]。本文旨在探討GRP78在胰腺癌中的表達(dá)及預(yù)后意義，為探索新的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料胰腺癌組織芯片(HPan-Ade180Sur-02)購(gòu)自上海芯超公司。組織芯片含有胰腺癌組織100例，相應(yīng)癌旁組織80例，每例有1個(gè)組織塊。所有患者在術(shù)前均未接受過(guò)放、化療或生物學(xué)治療，且對(duì)參與的研究均知情同意。在手術(shù)標(biāo)本中隨機(jī)挑選20例新鮮胰腺癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁正常胰腺組織-196 ℃液氮保存，用于qRT-PCR檢測(cè)。

1.2 免疫組化石蠟標(biāo)本4 μm厚切片，免疫組化染色采用EnVision法，DAB顯色。GRP78(多克隆抗體，兔抗，克隆號(hào)：ab32618)購(gòu)自Abcam公司。GRP78陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)。按細(xì)胞著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)計(jì)分結(jié)果相乘作為最終結(jié)果：0～4分為低表達(dá)，≥5分為高表達(dá)。

1.3 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析采用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)對(duì)GRP78 mRNA在171例正常胰腺組織與179例胰腺癌組織中的表達(dá)進(jìn)行分析。

1.4 qRT-PCR采用TRIZOL試劑盒提取胰腺癌和癌旁正常組織總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用qRT-PCR檢測(cè)GRP78基因的表達(dá)。GRP78引物序列：上游5′-TGTTCAACCAATTATCAGCAAACTC-3′，下游5′-TTCTGCTGTATCCTCTTCACCAGT-3′。β-actin引物序列：上游5′-CACCATTGGCAATGAGCGGT TCC-3′，下游5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、63 ℃ 30 s，合計(jì)40個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)結(jié)束后分析溶解曲線，每個(gè)組織樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，按照2-ΔΔCt計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)。Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素分析。Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank法比較組間生存差異。應(yīng)用Prism 7.0軟件繪制生存曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征100例胰腺癌中男性63例，女性37例?；颊吣挲g34～85歲，中位年齡61歲。腫瘤直徑≤4 cm者61例、>4 cm者39例。腫瘤位于胰頭62例、胰體尾37例。組織類型：導(dǎo)管腺癌91例、腺鱗癌6例、黏液腺癌3例。腫瘤病理分級(jí)：中分化68例、低分化32例。依據(jù)2009年美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)第7版胰腺癌分期：Ⅰ期40例、Ⅱ期58例，Ⅲ期0例，Ⅳ期2例。

2.2 胰腺癌中GRP78的表達(dá)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析：GRP78 mRNA在179例胰腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于171例癌旁正常組織(P<0.05，圖1)。免疫組化檢測(cè)100例胰腺癌組織中GRP78蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：35例(35%)低表達(dá)，65例(65%)高表達(dá)；GRP78蛋白在癌旁正常導(dǎo)管上皮中44例低表達(dá)(55%)，36例(45%)高表達(dá)，兩組相比差異有顯著性(P=0.007，圖2)。qRT-PCR檢測(cè)20對(duì)胰腺癌組織和癌旁正常組織，結(jié)果顯示：GRP78 mRNA相對(duì)表達(dá)量在胰腺癌組織中為(208.89±37.31)%，在癌旁正常組織中為(100.00±11.56)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 胰腺癌和癌旁組織中GRP78 mRNA的表達(dá)(GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù))

AB

2.3 胰腺癌中GRP78蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系癌組織中GRP78蛋白表達(dá)上調(diào)與腫瘤直徑>4 cm(P=0.036)、分化程度低(P=0.019)及較高的T分期(P=0.017)密切相關(guān)，與患者性別、年齡、腫瘤部位、N分期及AJCC臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性(表1)。

表1 胰腺癌中GRP78表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 預(yù)后分析單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、N分期、AJCC分期及GRP78表達(dá)與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)(P<0.05，表2)。多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度是胰腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素(P=0.005，表3)。生存分析顯示，癌組織中GRP78蛋白高表達(dá)組患者的總生存時(shí)間低于低表達(dá)組(P=0.010，圖3)。

圖3 胰腺癌組織中GRP78蛋白高表達(dá)組與低表達(dá)組患者生存曲線

表2 影響胰腺癌預(yù)后的單因素分析

表3 影響胰腺癌預(yù)后的多因素分析

3 討論

GRP78也稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein in pre-B cells, BiP)，是一種分子伴侶，屬于熱休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)家族[5]。GRP78蛋白主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與蛋白質(zhì)折疊和組裝，以及錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解[7]。在實(shí)體腫瘤中，缺氧、葡萄糖或營(yíng)養(yǎng)缺乏、乳酸酸中毒等腫瘤微環(huán)境觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。GRP78蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄激活的必要成分[8]。大量研究表明，GRP78蛋白高表達(dá)可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、存活、抗凋亡、免疫逃逸、轉(zhuǎn)移、血管生成和耐藥[9]。相反，通過(guò)抗GRP78特異性抗體中和GRP78可以在體、內(nèi)外抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[10]。因此，GRP78表達(dá)可以作為腫瘤生物學(xué)行為和治療反應(yīng)的生物學(xué)標(biāo)志物，以及作為新療法的潛在靶標(biāo)。

GRP78蛋白作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，其在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如胃癌[8]、乳腺癌[4]、前列腺癌[11]、惡性黑色素瘤[12]等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且血清GRP78蛋白水平可以評(píng)估乳腺癌的治療效果和預(yù)測(cè)預(yù)后[4]。Niu等[6]發(fā)現(xiàn)，與鄰近非腫瘤組織正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比，GRP78蛋白在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)更高，而且在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)與較高的T分期和較短的總生存期密切相關(guān)。本組通過(guò)GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)和免疫組化檢測(cè)分析GRP78基因和蛋白的表達(dá)，數(shù)據(jù)顯示：與癌旁正常導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比，GRP78 mRNA和蛋白在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)。此外，本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GRP78蛋白上調(diào)與腫瘤直徑>4 cm、分化程度低及較高的T分期顯著相關(guān)，并且癌組織中GRP78蛋白高表達(dá)的患者總生存期較短，表明GRP78在胰腺癌的進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，并可作為胰腺癌患者早期有效診斷和術(shù)后預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物。GRP78在癌旁正常胰腺腺泡細(xì)胞中高表達(dá)，原因可能是癌旁的腺泡細(xì)胞受到慢性炎癥刺激，誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[6,13]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在癌旁胰腺腺泡細(xì)胞中GRP78蛋白高表達(dá)的現(xiàn)象。

GRP78蛋白在惡性腫瘤進(jìn)展中的主要作用是促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，GRP78通過(guò)提高CyclinD1、CDK4和CDK6的表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖[6]。CyclinD1、CDK4和CDK6是控制細(xì)胞增殖G1期的關(guān)鍵蛋白，GRP78可能通過(guò)改變細(xì)胞周期來(lái)影響胰腺癌細(xì)胞的增殖[6]。GRP78蛋白過(guò)表達(dá)通過(guò)增加基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopeptidase, MMP)的分泌和活性以及調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)來(lái)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲，F(xiàn)AK和JNK是GRP78誘導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵下游信號(hào)傳導(dǎo)。一項(xiàng)體外研究表明，GRP78通過(guò)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胰腺癌組織中GRP78基因和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，并且與較低的分化程度和較高的T分期有關(guān)，提示患者預(yù)后不良。GRP78蛋白在胰腺癌進(jìn)展中具有重要作用，其生物學(xué)機(jī)制仍需要進(jìn)一步分析，可能提高胰腺癌患者的早期診斷效率，有望成為靶向治療的新靶點(diǎn)。