陳 銳，徐 皓，胡光華

（1.長(zhǎng)春市食品藥品檢驗(yàn)中心化學(xué)室，吉林 長(zhǎng)春 130000；2.長(zhǎng)春市食品藥品檢驗(yàn)中心抗生素室，吉林 長(zhǎng)春 130000）

鹽酸諾氟沙星為喹諾酮類藥物是一種人工合成的、抗菌譜廣泛的高效抗菌藥[1]。鹽酸諾氟沙星作用于細(xì)菌DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ與其形成復(fù)合物，抑制細(xì)菌DNA的合成與復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。主要用于治療敏感細(xì)菌（葡萄球菌、肺炎球菌、腸球菌）引起的泌尿道、呼吸道及胃腸道感染。為有效控制鹽酸諾氟沙星的質(zhì)量, 對(duì)該原料藥有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法進(jìn)行研究，對(duì)含量大于0.1%的雜質(zhì)運(yùn)用HPLCMS聯(lián)用進(jìn)行定量分析，并使用質(zhì)譜對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行定性分析，為鹽酸諾氟沙星建立安全有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑及儀器

鹽酸諾氟沙星原料藥(常州方圓藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：191025) ；諾氟沙星雜質(zhì)A（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130610-201909）；諾氟沙星雜質(zhì)B（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130611-201901） 乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為去離子水。

HP1100高效液相色譜儀（Agilent）；ZMDMicromass電噴霧質(zhì)譜儀（美國waters）； AB265-S電子天平（德國meuler公司）

1.2 檢測(cè)條件

HP1100高效液相色譜儀（Agilent），色譜柱：ODS柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相： 0.025mol/L磷酸（用三乙胺調(diào)節(jié)PH至3.0）-乙腈（84：16），流速為1mL/min，樣溫為室溫，進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣。ZMDMicromass電噴霧質(zhì)譜儀（美國waters），ESI離子源，正離子掃描， 3.0kV的毛細(xì)管電壓，電噴霧接口干燥氣(N2)流速為540L/h,離子源溫度為100℃；錐孔電壓為30V，脫溶劑氣溫為130℃；質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z：100～800。

2 方法與結(jié)果

2.1 各溶液的制備

精密稱取鹽酸諾氟沙星原料藥10mg，置100ml量瓶中，加適量流動(dòng)相進(jìn)行溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 m l，置于2 5 m l量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用0.22μm濾膜濾過，作為供試品溶液；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液；采用自身對(duì)照法，利用諾氟沙星的峰對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行含量計(jì)算，其中有A和B的含量大于0.1%。

另精密稱取雜質(zhì)A和雜質(zhì)B對(duì)照品適量，置于200ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量， 用流動(dòng)相定量稀釋制成質(zhì)量濃度分別為20.0μg/ml的雜質(zhì)A和B混合對(duì)照品溶液。

2.2 線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品溶液，按稀釋倍數(shù)為1、1.2、1.5、2、3、6依次逐級(jí)稀釋，定容，制得6個(gè)濃度梯度的系列混合對(duì)照品溶液，按照上述質(zhì)譜條件測(cè)定，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得各成分回歸方程、r、線性范圍。雜質(zhì)A的回歸方程為Y=1.69X+10566×C，r=0.9998，線性范圍為2.934-11.683μg/ml；雜質(zhì)B的回歸方程為Y=1.35X+32451×C，r=0.9999，線性范圍為5.623-28.625μg/ml。

2.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取供試液溶液進(jìn)樣，對(duì)各組分峰的分離度進(jìn)行計(jì)算，均符合規(guī)定。

2.3 專屬性考察，

精密稱取鹽酸諾氟沙星原料藥，分別制備酸破壞樣品溶液，堿破壞樣品溶液，氧化破壞樣品溶液，光照破壞樣品溶液，高溫破壞樣品溶液。經(jīng)破壞后產(chǎn)生的降解產(chǎn)物在上述色譜條件下，與主峰的分離度都較好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取鹽酸諾氟沙星原料藥，按“2.1”中的方法進(jìn)行制備，在0、1、2、4、8、12、24 h時(shí)分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果：諾氟沙星各時(shí)間點(diǎn)峰面積的RSD=0.72%，說明供試液在24h之內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.5 精密度試驗(yàn)

在上述色譜條件下，對(duì)“2.1”中配制的供試液連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算雜質(zhì)A和B峰面積的RSD分別為0.58%和0.67%，說明本實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.6 檢出限考察

用流動(dòng)相將供試品溶液逐步稀釋，并依次進(jìn)樣檢測(cè)，當(dāng)信噪比 (S/N) 為3時(shí)，雜質(zhì)A和B的檢出限均為0.1ng。

2.7 定量限考察

用流動(dòng)相將供試品溶液逐步稀釋，并依次進(jìn)樣檢測(cè)，當(dāng)信噪比 (S/N) 為10時(shí)，雜質(zhì)A和B的定量限分別為0.2578ng和0.2842ng。

2.8 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取已測(cè)得雜質(zhì)A、雜質(zhì)B含量的鹽酸諾氟沙星9份， 每3份分別加入高、中、低3個(gè)不同濃度的雜質(zhì)A和雜質(zhì)B的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，雜質(zhì)A 的平均加樣回收率為99.89%，RSD=0.79%；雜質(zhì)B的平均加樣回收率為100.52%，RSD=0.82%。

2.9 樣品測(cè)定

取5個(gè)批次的樣品進(jìn)行檢測(cè)，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均檢出雜質(zhì)A和B，結(jié)果見表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果

2.10 結(jié)構(gòu)解析

對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)并提取雜質(zhì)A和B質(zhì)譜全掃描圖，結(jié)果雜質(zhì)A的母離子m/z為269.66，雜質(zhì)B的母離子m/z為293.30。對(duì)其進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定其分子式和結(jié)構(gòu)式，結(jié)果見表2。

表2 鹽酸諾氟沙星雜質(zhì)A、B的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

3 討 論

本研究中選用的諾氟沙星原料藥符合企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。選擇0.025mol/L磷酸（用三乙胺調(diào)節(jié)PH至3.0）-乙腈（84：16）作為流動(dòng)相可使主成分峰以及各有關(guān)物質(zhì)峰均實(shí)現(xiàn)良好的分離，有關(guān)物質(zhì)可被有效檢出。根據(jù)質(zhì)譜對(duì)含量大于0.1%的雜質(zhì)A和B進(jìn)行解析，表明該方法可簡(jiǎn)便快速并以較高的專屬性尋找諾氟沙星原料藥中的雜質(zhì)。同時(shí)依據(jù)解析過程可推測(cè)雜質(zhì)A可能是在原料藥合成過程中引入，雜質(zhì)B的形成可能是在酸性條件下發(fā)生了脫羧反應(yīng)或在氧化條件下發(fā)生了哌嗪環(huán)的氧化反應(yīng)。本研究為鹽酸諾氟沙星原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立以及雜質(zhì)的檢出方面提供了理論依據(jù)。