陳榮橋，陳漢金，胡均鵬，冼燕萍，楊靜，王斌，朱文信，劉冬虹，侯向昶，劉春生，吳玉鑾，周穎璇

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣州市食品安全風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與預(yù)警研究中心，廣州市食品安全檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511447）

椰毒假單胞菌酵米面亞種（Pseudomonas cocovenenanssubsp.farinofermentans，又稱椰毒伯克霍爾德菌[1]）是唐菖蒲伯克霍爾德菌（Burkholderia gladioli）的一種病原型，容易污染谷類發(fā)酵制品（酵米面、玉米淀粉、醋涼粉等）、銀耳、木耳及薯類制品（馬鈴薯粉條、甘薯淀粉、山芋淀粉等）[2]。椰毒假單胞菌酵米面亞種廣泛存在于環(huán)境土壤中，生長(zhǎng)繁殖溫度為 30～36 ℃，最佳產(chǎn)毒溫度為 26～28 ℃。米酵菌酸是椰毒假單胞菌酵米面亞種產(chǎn)生的主要外毒素，對(duì)人和動(dòng)物有強(qiáng)烈的毒性作用，美國(guó)《食品毒理學(xué)》研究表明人體血液中米酵菌酸含量達(dá)到200～300 μg/L即可達(dá)到致死劑量，人群中毒事件反映經(jīng)口攝入含31 mg米酵菌酸的食物可致死亡，米酵菌酸中毒死亡率高達(dá)40%～100%，且米酵菌酸耐熱，一般烹調(diào)方法不能破壞其毒性[3,4]。

米酵菌酸中毒機(jī)理是抑制線粒體腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)位酶（ANT）而產(chǎn)生毒性作用[5,6]。發(fā)病潛伏期一般為30 min～12 h，少數(shù)長(zhǎng)達(dá)1～2 d，中毒早期多為胃腸道刺激，表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉等，病情進(jìn)展迅速，嚴(yán)重發(fā)展為腦、肝、腎多器官功能衰竭[7,8]。由椰毒假單胞菌酵米面亞種污染食物而引發(fā)米酵菌酸中毒事件在我國(guó)時(shí)有報(bào)道，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，自20世紀(jì)中期以來，報(bào)道的此類事件影響人數(shù)累計(jì)超過2000人，死亡人數(shù)超過900人，中毒食物有發(fā)酵變質(zhì)的玉米制品、變質(zhì)銀耳和長(zhǎng)時(shí)間泡發(fā)的木耳等，涉及省份包括東北三省、四川、云南、浙江、廣西和廣東等[2,9-12]。其中，2018年廣東省河源市和東莞市也接連發(fā)生了因食用過期濕粉條而引起家庭米酵菌酸中毒事件[4,7]。由此可見，椰毒假單胞菌酵米面亞種污染及其毒素中毒事件已經(jīng)危及人們身體健康和生命安全，應(yīng)當(dāng)提高重視程度。

本研究率先在我國(guó)南方部分省份的一些糧食加工制品生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行調(diào)研并采集了米（大米和碎米）、食用淀粉（玉米淀粉、小麥淀粉和木薯淀粉）樣品，同時(shí)也在市場(chǎng)上隨機(jī)購(gòu)買了一些大米樣品，開展椰毒假單胞菌酵米面亞種及其毒素米酵菌酸污染摸查和風(fēng)險(xiǎn)分析研究。首次在4份進(jìn)口碎米和1份國(guó)產(chǎn)碎米中分離鑒定出6株唐菖蒲伯克霍爾德菌，其中4株為產(chǎn)毒素的椰毒假單胞菌酵米面亞種（均源自進(jìn)口碎米），有1份進(jìn)口碎米同時(shí)分離出1株產(chǎn)毒菌株和1株不產(chǎn)毒菌株，在2份進(jìn)口碎米中同時(shí)檢出米酵菌酸；國(guó)產(chǎn)碎米中分離出1株不產(chǎn)毒株。研究表明進(jìn)口碎米存在椰毒假單胞菌酵米面亞種污染的安全風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 原料

2020年4～6月，從我國(guó)南方部分省份采集米和食用淀粉樣品共129份，其中47份大米、18份碎米和64份淀粉樣品（具體見表1，其中產(chǎn)地信息均為產(chǎn)品包裝標(biāo)識(shí)），樣品采自糧食加工制品生產(chǎn)企業(yè)和廣州本地超市或市場(chǎng)。采樣時(shí)，為了避免二次污染，對(duì)于小包裝規(guī)格的產(chǎn)品則整包購(gòu)買，對(duì)于大包裝規(guī)格的產(chǎn)品則從新開封的產(chǎn)品中取出適量樣品后即裝入無菌均質(zhì)袋并密閉包裝，每件樣品至少500 g。

1.2 儀器和試劑

VITEK 2 Compact自動(dòng)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)，法國(guó)梅里埃公司；生物安全柜，Thermo scientific；高壓滅菌鍋（Hirayama HVE 50）；恒溫培養(yǎng)箱，Binder；天平（PL6001E）；移液槍，transfepette；ACQUITYTM超高效液相色譜儀和Waters XevoTM TQ MS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，Waters公司。

GVC增菌液、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖半固體瓊脂培養(yǎng)基、卵黃瓊脂培養(yǎng)基和SS瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；VITEK 2 Compact GN鑒定卡，法國(guó)梅里埃公司；玻璃紙和旋蒸儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg/mL），Sigma Aldrich；甲醇和乙腈（HPLC級(jí)），德國(guó)Merck公司；甲酸（HPLC級(jí)），德國(guó)CNW公司；氨水（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；MAX固相萃取小柱（6 mg/3 mL），Waters公司；超純水（18.2 MΩ·cm），實(shí)驗(yàn)室Milli-Q自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

按照GB/T 4789.29-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗(yàn)》對(duì)所有樣品進(jìn)行處理和分離菌株[13]，生化鑒定采用VITEK 2 Compact自動(dòng)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)經(jīng)VITEK 2 Compact確認(rèn)的唐菖蒲伯克霍爾德菌，進(jìn)一步開展毒性試驗(yàn)，對(duì)產(chǎn)毒培養(yǎng)獲得的毒素粗提液采用小白鼠灌胃進(jìn)行毒力測(cè)定，同時(shí)測(cè)定米酵菌酸。

參考GB 5009.189-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中米酵菌酸的測(cè)定》的前處理方法[14]，建立了檢測(cè)米酵菌酸的超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，儀器檢出限為0.3 μg/L。UPLC-MS/MS檢測(cè)色譜條件：BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫程序?yàn)椋?.0～3.0 min，50%～70% A，3.0～3.6 min，70%～95% A，3.6～5.5 min，95% A，5.5～5.6 min，95%～50% A，5.6～7.0 min，50% A；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件：電離方式為電噴霧負(fù)離子（ESI-）模式；毛細(xì)管電壓2 kV，錐孔電壓10 V；去溶劑溫度500 ℃；去溶劑氣為氮?dú)猓?00 L/Hr；錐孔氣為氮?dú)猓?0 L/Hr；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），米酵菌酸和異米酵菌酸的特征離子對(duì)（m/z）均為485.3/397.3和485.3/441.3（定量），碰撞能分別為20 eV和10 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)使用Origin 9軟件作圖，每項(xiàng)數(shù)據(jù)實(shí)驗(yàn)三次取平均值處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 米和食用淀粉的污染情況

本次實(shí)驗(yàn)共采集129份，發(fā)現(xiàn)大米和碎米存在唐菖蒲伯克霍爾德菌、類鼻疽伯克霍爾德菌和熒光假單胞菌污染（見表1）。其中，在4份進(jìn)口碎米樣品中檢出5株唐菖蒲伯克霍爾德菌（4株為產(chǎn)毒菌株和1株不產(chǎn)毒菌株），即在 1份進(jìn)口碎米樣品中同時(shí)檢出 1株產(chǎn)毒菌株和1株不產(chǎn)毒菌株；1份國(guó)產(chǎn)碎米中檢出1株不產(chǎn)毒菌株。

表1 米和食用淀粉樣品中細(xì)菌污染情況Table 1 Contamination of various samples of Bacteria

表2 疑似菌落在PDA平板和卵黃瓊脂平板上形態(tài)特征[13]Table 2 Characteristics of suspected colonies on PDA plate and egg yolk agar plate

2.2 樣品在不同分離平板上疑似菌落的形態(tài)特征及生化特性

2.2.1 在 PDA平板和卵黃瓊脂平板上的菌落特征

樣品加入GVC增菌培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后劃線分離培養(yǎng)[13]，在 13個(gè)樣品中發(fā)現(xiàn)疑似唐菖蒲伯克霍爾德菌株14株，其中在1個(gè)樣品中發(fā)現(xiàn)了2株。14株疑似菌落在PDA平板和卵黃平板上呈現(xiàn)出5種形態(tài)特征，如表2、圖1和圖2所示。5種菌落形態(tài)特征與GB/T 4789.29-2003的菌落特征描述較相似[13]。

圖1 PDA平板上菌落特征Fig.1 Characteristics of colony on PDA plate

圖2 卵黃瓊脂平板上菌落特征Fig.2 Characteristics of colony on egg yolk agar plate

2.2.2 疑似菌落的生化特性

將上述5種類型菌落在卵黃瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，挑取典型單一菌落接種PDA平板培養(yǎng)24 h，然后用VITEK 2 Compact生化鑒定分析，具體的鑒定結(jié)果見表3。

表3 類型1～5的生化反應(yīng)結(jié)果Table 3 Biochemical reaction results of type 1～5

注：當(dāng)生化反應(yīng)結(jié)果稍低于閾值時(shí)顯示為弱陰性（-），當(dāng)生化反應(yīng)結(jié)果稍高于閾值時(shí)顯示為弱陽性（+）。

鑒定結(jié)果表明，3號(hào)和4號(hào)菌株為唐菖蒲伯克霍爾德菌，1號(hào)菌株為類鼻疽伯克霍爾德菌，2號(hào)菌株為熒光假單胞菌，5號(hào)菌株未能鑒定出細(xì)菌種類。從生化反應(yīng)特性上看，類鼻疽伯克霍爾德菌和唐菖蒲伯克霍爾德同屬于伯克霍爾德菌屬，故兩者的生化差異不大，主要區(qū)別在于唐菖蒲伯克霍爾德菌可利用側(cè)金盞花醇(ADO)，類鼻疽伯克霍爾德菌可利用D-纖維二糖(dCEL)、D-麥芽糖(dMAL)、蔗糖(SAC)以及 D-海藻糖(dTRE)；熒光假單胞菌在生化反應(yīng)上大部分和唐菖蒲伯克霍爾德菌類似，主要區(qū)別在于D-甘露醇(dMAN)、L-脯氨酸芳胺酶(ProA)和D-山梨醇(dSOR)；未能鑒定的菌株生化反應(yīng)與唐菖蒲伯克霍爾德菌的也大部分相似，也有可能是伯克霍爾德菌屬中的一種。

2.3 唐菖蒲伯克霍爾德菌的毒性試驗(yàn)

2.3.1 毒力測(cè)試

將鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌的6株菌株，分別編號(hào)為S1、S2、S3、S4、S5和S6，其中S2和S3為同 1份碎米樣品分離出的2株菌株（見表 4）。按照GB/T 4789.29-2003進(jìn)行產(chǎn)毒培養(yǎng)，提取粗毒素，分別對(duì)體重18～20 g的小白鼠經(jīng)口灌胃[13,15,16]。菌株S3和S6的粗毒素灌胃的小白鼠均沒有死亡，菌株S1、S2、S4和S5的粗毒素灌胃的小白鼠均在24 h內(nèi)死亡，表明菌株S3和S6為不產(chǎn)毒株，菌株S1、S2、S4和S5為產(chǎn)毒株。

表4 S1-S6培養(yǎng)物中米酵菌酸的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of Bongkrekic acid in S1-S6 culture

2.3.2 培養(yǎng)物中米酵菌酸的測(cè)定

將6株唐菖蒲伯克霍爾德菌的產(chǎn)毒培養(yǎng)物檢測(cè)米酵菌酸（見表4），其中S1、S2、S4和S5的米酵菌酸含量在162.60～255.90 mg/kg，證實(shí)這4株為產(chǎn)毒株；S3和S6的培養(yǎng)物未檢出米酵菌酸，證實(shí)為不產(chǎn)毒株。米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）和菌株S1粗毒素（b）的提取離子色譜圖見圖 3，可見，椰毒假單胞菌酵米面亞種產(chǎn)的毒素包括米酵菌酸和異米酵菌酸，有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)異米酵菌酸的毒性約為米酵菌酸的1/2～1/4[17,18]，由于尚無異米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品售賣，本研究將（米酵菌酸峰面積+異米酵菌酸峰面積）與米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積比較定量，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，與將米酵菌酸和異米酵菌酸合成單峰的定量結(jié)果一致。

2.4 米和食用淀粉中米酵菌酸的測(cè)定

圖3 米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）、椰毒假單胞菌毒素提取物（b）、陽性大米樣品（c和d）、陽性碎米樣品（e和f）的提取離子色譜圖Fig.3 Extraction ion chromatograms of bongkrekic acid standard solution (a), toxin extract of Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans (b), positive rice samples(c and d), positive broken rice samples (e and f)

129份米和食用淀粉樣品中，有2份大米和2份碎米（表4中碎米2和碎米4）檢出米酵菌酸，含量分別為2.70、0.70、2.40和1.00 μg/kg。在檢出米酵菌酸的2份大米中并未檢出椰毒假單胞菌酵米面亞種，可能是由于菌在大米中分布極不均勻，且樣品含有大量霉菌，霉菌與椰毒假單胞菌酵米面亞種生長(zhǎng)條件基本一致，但是霉菌生長(zhǎng)速度快，PDA平板培養(yǎng)時(shí)霉菌快速生長(zhǎng)并基本鋪滿整個(gè)平板，難以辨別椰毒假單胞菌酵米面亞種菌落；檢出米酵菌酸的2份碎米同時(shí)也檢出了椰毒假單胞菌酵米面亞種，米酵菌酸含量雖然很低，但是表明菌已經(jīng)在產(chǎn)毒，存在安全風(fēng)險(xiǎn)。

陽性大米（c、d）和陽性碎米（e、f）的提取離子色譜圖見圖 3，均包含了米酵菌酸和異米酵菌酸 2個(gè)峰。

3 結(jié)論

本研究主要針對(duì)食品工業(yè)中常用的米和食用淀粉樣品進(jìn)行椰毒假單胞菌酵米面亞種污染風(fēng)險(xiǎn)摸查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，首次在4份進(jìn)口碎米和1份國(guó)產(chǎn)碎米中分離鑒定出6株唐菖蒲伯克霍爾德菌，在碎米樣品中的檢出率為27.78%（5/18）；經(jīng)過毒性試驗(yàn)，其中4株證實(shí)為產(chǎn)毒素米酵菌酸的椰毒假單胞菌酵米面亞種，均源自4份進(jìn)口碎米（其中2份碎米檢出米酵菌酸），占進(jìn)口碎米樣品的 23.53%（4/17）。試驗(yàn)研究表明進(jìn)口碎米存在椰毒假單胞菌酵米面亞種污染風(fēng)險(xiǎn)。碎米是一些糧食加工制品生產(chǎn)企業(yè)的原料，如果存放不當(dāng)，尤其是濕熱季節(jié)，容易為椰毒假單胞菌酵米面亞種的生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)毒素提供條件，而目前相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范并沒有將該菌納入碎米安全指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，企業(yè)在采購(gòu)使用碎米時(shí)對(duì)此風(fēng)險(xiǎn)也處于未認(rèn)知狀態(tài)，這有可能導(dǎo)致源頭污染風(fēng)險(xiǎn)傳遞至下游各個(gè)環(huán)節(jié)，因此，建議監(jiān)管部門打好相關(guān)防控組合拳，企業(yè)加強(qiáng)相關(guān)防控，共同有效預(yù)防由該菌引起的食物中毒事件發(fā)生。