方雙琪，張帥，陳艷，張小軍,3，梅光明,3

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江舟山 316021）（2.浙江省海洋大學食品與藥學學院浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心，浙江舟山 316021）（3.浙江省海洋水產研究所，浙江舟山 316021）

抗生素是一種通過干擾細胞發(fā)育功能而達到抑菌或殺菌效果的化合物[1]，在水產養(yǎng)殖過程中，抗生素曾被當做漁藥和飼料添加劑使用，具有防治細菌性疾病、提高飼料利用率及促進生長等一系列作用[2]。近年來，由于抗生素不合理使用導致細菌的耐藥性不斷增強以及水產品中的藥物殘留問題日益嚴重，抗生素逐漸被限量或禁止在水產養(yǎng)殖中使用。但現(xiàn)代化高密度、集約化的工廠化養(yǎng)殖使得水產品病害情況日益多發(fā)，為了挽回經濟損失，化學抗生素類藥物仍被一些養(yǎng)殖戶非法使用，甚至多種抗生素聯(lián)合使用來達到更好的治療效果。因作用機制的不同，抗生素類藥物聯(lián)合使用時經常產生藥物相互作用，導致藥效的增強或降低，影響藥物的代謝甚至引起毒副作用[3]，因此，研究抗生素之間聯(lián)合使用時藥物在機體內的消除過程及影響很有必要。

呋喃唑酮（Furazolidone）是一種具有5-硝基呋喃環(huán)基本結構的廣譜抗菌藥物[4],曾因高效的抗菌性和相對低廉的成本被廣泛用作獸藥或飼料添加劑以治療人工養(yǎng)殖動物如魚、蝦、豬、雞等的細菌性疾病。眾多研究表明，呋喃唑酮在機體內幾個小時便能全部代謝結束，但其代謝產物3-氨基-2-惡唑烷酮（AOZ）卻能以蛋白結合態(tài)的形式在體內穩(wěn)定而持久的存在，具有潛在的三致作用（致畸、致癌、致突變）[5]。因此，為了確保動物源性食品安全并防止呋喃唑酮危害人類健康，許多國家逐漸禁止在禽畜及水生養(yǎng)殖動物中使用呋喃唑酮[6]。目前，對于呋喃唑酮的研究通常集中其原藥和代謝物在水產動物體內的代謝上，但是關于抗生素藥物對呋喃唑酮代謝物殘留消除影響的報道仍然少見。本實驗選擇磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）、土霉素（Oxytetracycline）和恩諾沙星（Enrofloxacin）三種常見的抗生素類漁藥與呋喃唑酮聯(lián)合使用，以鯽魚為研究對象，模擬網箱養(yǎng)殖，探討這三種抗生素類漁藥對呋喃唑酮代謝物在鯽魚體內的殘留消除的影響，為禁用藥物的研究提供更多的參考，進而推動養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，保障消費者身體健康。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗中使用的健康鯽魚購于浙江省舟山市臨城老碶農貿菜場，體重150±10 g，體長16±2 cm。經隨機抽樣檢測，鯽魚體內不含呋喃唑酮原藥及其代謝物。選用經氧氣泵24 h曝氣去氯處理的自來水作為實驗用水，水溫22±1 ℃，pH=7。實驗前將鯽魚放在帶有增氧泵的橘黃色聚乙烯養(yǎng)魚缸中暫養(yǎng)3 d，使其適應養(yǎng)殖環(huán)境，挑選個頭均勻，外觀健康的鯽魚進行實驗。

1.2 藥品與試劑

呋喃唑酮，質量分數(shù)≥99%，由浙江省海洋水產研究所提供；呋喃唑酮代謝物標準品（AOZ），質量分數(shù)≥99.80%，美國Sigma公司；呋喃唑酮內標AOZ-D4，質量分數(shù)≥99.80%美國 Sigma公司；乙酸銨、2-硝基苯甲醛、甲醇、甲酸為色譜純，乙酸乙酯、鹽酸、二甲基亞砜、磷酸氫二鉀為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水。

1.3 儀器與設備

ACQUITY型高效液相色譜儀，美國Waters公司；Quattro Preemier XE型串聯(lián)三重四級桿質譜儀，美國Waters公司；LPD2550型多管渦旋混合儀，萊普特科學儀器有限公司；AvantiJXN-30型貝克曼離心機，庫特爾商貿有限公司；ZD-85型恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；Nitrogen Evaporator 112型氮吹儀，美國Organomatio公司；微孔濾膜（0.22 μm），津騰。

1.4 實驗設計

鯽魚暫養(yǎng)3 d后，按每組15～20尾的數(shù)量隨機分為5組（A0～A4），分別飼養(yǎng)在150 L聚乙烯養(yǎng)魚箱中。A0為空白對照組，A1為呋喃唑酮單獨給藥對照組，A2為土霉素-呋喃唑酮聯(lián)合給藥組，A3為恩諾沙星-呋喃唑酮聯(lián)合給藥組；A4為磺胺間甲氧嘧啶-呋喃唑酮聯(lián)合給藥組。實驗組A1-A4均采用藥浴方式給藥。實驗前呋喃唑酮、土霉素、恩諾沙星、磺胺間甲氧嘧啶分別用乙腈、鹽酸、醋酸、氫氧化鈉助溶后再潑灑到養(yǎng)魚箱中，且每個養(yǎng)魚箱水體中的單個藥物質量濃度均為 100 μg/kg。

為避免呋喃唑酮見光分解，藥浴在晚上進行，藥浴時長均為12 h，水溫22±1 ℃。藥浴結束后徹底換清水，且分別于藥浴結束后的0、5、10、48、96 h時間點在實驗組中隨機選取3條魚，作為3個平行樣品。將鯽魚解剖，取其背部肌肉、腎臟、肝臟，置于-18 ℃冰箱保存，待HPLC-MS/MS分析。

1.5 鯽魚體內AOZ的提取與凈化

取肌肉樣品2.0±0.10 g，肝臟、腎臟各1±0.10 g于50 mL離心管中，加入100 ng/mL的內標工作液0.10 mL，渦旋混合50 s后加入5 mL 0.20 mol/L鹽酸溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，放入氣浴振蕩器37 ℃避光衍生16 h。

取出離心管放置冷卻到室溫，加入1 moL/L磷酸氫二鉀溶液4.5～5 mL，調節(jié)pH至7.0～7.5；加入8 mL乙酸乙酯提取，渦旋振蕩5 min，再6500 r/min 6 ℃低溫離心6 min；取上清液40 ℃下氮氣吹干。肌肉殘渣用1.0 mL甲醇水溶液（1:9）溶解，振蕩后經0.22 μm有機濾膜過濾至進樣瓶，待測；內臟殘渣加入 1 mL正己烷溶解油脂后加入甲醇水，振蕩20 s，4500 r/min 4 ℃再次低溫離心5 min，取下層溶液過濾膜，待測。

1.6 檢測方法

1.6.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEHC18柱（2.1 mm×50 mm×1.7 mm）；樣品室溫度10 ℃；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流速0.2 mL/min；流動相A為包含0.1%甲酸和2 mmol/L乙酸銨的溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序見表1。

表1 流動性梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of the mobile phase

1.6.2 質譜條件

離子化模式：電噴霧電離源（ESI+）；離子源溫度：120 ℃；掃描模式：多反應監(jiān)測（MRM），多反應質譜監(jiān)測實驗條件（例如母離子，產物離子，錐電壓和碰撞能量）列于表2。

表2 MRM模式下質譜測定的特征離子Table 2 Characteristic ions of mass spectrum determination in MRM mode

1.7 標準曲線繪制

分別準確移取10 ng/mL標準工作液0.10、0.5 mL，100 ng/mL標準工作液0.10、0.25、0.50 mL和1 μg/mL標準工作液0.10 mL于6個離心管中，除不加樣品外，按1.5步驟操作，步驟1.6的儀器條件進行測定。采用內標法繪制標準曲線，以分析物與內標物峰面積比值為縱坐標，分析物質量濃度為橫坐標進行線性回歸，得到回歸方程和相關系數(shù)R。

1.8 回收率與精密度

將呋喃唑酮代謝物標準品添加到鯽魚的空白肌肉，肝和腎樣品中以制備3個濃度樣品，分別為1.0、5.0、10.0 μg/kg。按照1.5.1進行樣品處理后，步驟1.6進行測定，每個添加水平做三個平行，每個平行分別在一天內重復進樣3次。

1.9 數(shù)據(jù)處理

藥時曲線通過Origin 8.5進行繪制。AOZ的平均消除速率v計算公式參照劉書貴等[7]，公式為：

其中：Mmax、Mmin為消除過程中 AOZ殘留質量濃度的最大值和最小值；t1、t2為藥物濃度達到最大和最小值所需要的時間。

2 結果與討論

2.1 標準曲線與靈敏度

AOZ標準溶液衍生化后測定得到的標準曲線表明：AOZ在1.0～100.0 ng/mL濃度范圍內，線性關系良好，相關系數(shù)為 0.9999，線性方程為 y=0.36078x+0.06546

最低檢測限為三倍基線噪音的藥物質量比，定量限為十倍基線噪音藥物質量濃度。該測定方法對AOZ的檢測限（S/N＞3）為0.25 μg/kg，定量限（S/N＞10）為 0.5 μg/kg。

圖1 單獨和聯(lián)合給藥下鯽魚體內各組織中AOZ的藥時曲線Fig.1 The drug-time curve of AOZ in various tissues of crucian carp under single and combined administration

2.2 回收率與精密度

本試驗條件下，以1.0、5.0、10.0 μg/kg為三個添加水平，每個水平測定三次，測定得到 AOZ在鯽魚各組織中的回收率為 105%～108.60%，相對標準偏差為3.60%～7.80%。

2.3 給藥劑量及方式

隨著水產品質量安全監(jiān)管力度的不斷加大，各類禁用或限量抗生素均被列在水產品農獸藥殘留檢測名單中，即使養(yǎng)殖戶違法使用這些化學抗生素也不再高濃度給藥，為了切合實際養(yǎng)殖情況，本實驗選擇 100 μg/kg進行低劑量給藥。同時為了避免注射給藥造成魚體損傷以及拌飼投喂個體受藥不均勻的情況，試驗采用藥浴給藥的方式，模擬網箱養(yǎng)殖，藥浴給藥全程在水箱中進行，魚體呼吸沒有障礙，身體刺激小，每條魚都能在健康狀態(tài)下均勻給藥，且在一定范圍的藥浴時間內，魚體藥物殘留量與藥浴時間呈正相關。

2.4 AOZ在鯽魚組織中的分布與消除規(guī)律

鯽魚在每種藥物濃度100 μg/kg的水體中連續(xù)藥浴12 h后，對照組（A1）和三組聯(lián)合給藥組（A2～A4）鯽魚體內AOZ的分布和殘留情況如圖1所示。從圖1中可以看出，藥浴結束0 h后，對照組和聯(lián)合給藥組鯽魚體內腎臟、肝臟、肌肉組織中的 AOZ就已經被檢測出來，且在消除時間0～96 h內，各給藥組鯽魚體內三種組織中 AOZ的殘留量呈現(xiàn)相似的變化趨勢。在消除實驗的前期階段，給藥組中的 AOZ在鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中的含量隨著消除時間的增加都表現(xiàn)出波動下降的趨勢；消除48 h之后三種組織中的AOZ的質量濃度開始緩慢衰減；停藥96 h后，對照組及聯(lián)合給藥組鯽魚肝臟、腎臟和肌肉中仍然有大量 AOZ殘留，分別為6.62、8.95、1.32 μg/kg（A1組）；9.80、13.28、2.16 μg/kg（A2組）；11.8、12.30、2.94 μg/kg（A3組）；14.90、8.21、5.80 μg/kg（A4組）。且無論是對照組還是聯(lián)合給藥組中，鯽魚各組織中的最大殘留濃度均表現(xiàn)為腎臟＞肝臟＞肌肉。

2.5 三種抗生素對鯽魚體內AOZ殘留量的影響

表3為消除過程中單獨和聯(lián)合給藥下AOZ在鯽魚各組織中的最大殘留濃度（Cmax）及對應時間（Tmax）。由表3可知，藥浴結束后0 h，呋喃唑酮對照組（A1）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中 AOZ的含量便達到最大值，分別為 88.87、59.20、14.91 μg/kg。而土霉素-呋喃唑酮組（A2）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中AOZ的含量在5 h達到最大值分別為165.40、125.29、28.69 μg/kg，大約相當于對照組的 1.86、2.11、1.92倍；恩諾沙星-呋喃唑酮組（A3）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中AOZ的含量分別在0、10和10 h達到最大值，分別為46.70、41.64、9.69 μg/kg，僅約為對照組的 0.53、0.70、0.65倍。磺胺間甲氧嘧啶-呋喃唑酮組（A4）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中的AOZ含量也在0h達到最大值，分別為 90.20、70.95、18.30 μg/kg，與對照組相比也有升高但差異不大。

研究表明，聯(lián)合用藥引起的藥物相互作用會表現(xiàn)為胃腸道吸收的相互作用、競爭血漿蛋白結合點、誘導或抑制肝藥酶[8]、影響腎臟排泄等[9]，從而導致藥物或其代謝物在人體組織中殘留濃度和代謝的變化。例如青霉素與丙磺舒聯(lián)合使用后，丙磺舒為酸性藥物，可以抑制腎小管對青霉素的分泌從而使得青霉素的排泄減少、血藥濃度增加[10]；紅霉素和地高辛合用時，紅霉素會改變胃腸道的菌群，增加地高辛的血藥濃度并提高其生物利用率[11]。本實驗下，四種藥物經藥浴方式對鯽魚進行給藥，藥物經鯽魚皮膚和鰓吸收進入體循環(huán)，實驗結果表明，土霉素-呋喃唑酮組及恩諾沙星-呋喃唑酮組中AOZ在鯽魚組織中達峰時間與對照組相比有明顯不同，這可能是因為土霉素、恩諾沙星一定程度上延緩了鯽魚體內 AOZ的代謝；此外土霉素-呋喃唑酮組中達峰濃度與對照組相比顯著增加，而恩諾沙星-呋喃唑酮組明顯降低，說明這兩種抗生素影響了呋喃唑酮原藥在鯽魚體內的吸收及分布，改變了呋喃唑酮代謝物 AOZ在鯽魚組織中的濃度；但土霉素、恩諾沙星具體通過哪種作用方式影響鯽魚體內AOZ的殘留濃度暫不明確，還需進一步研究。

表3 0～96 h內鯽魚組織中AOZ的最大殘留濃度及對應時間Table 3 The maximum residual concentration and corresponding time of AOZ in crucian carp tissues within 0～96hours

2.6 三種抗生素對鯽魚體內AOZ消除的影響

表4為鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中AOZ的平均消除速率。表4可知，不同抗生素參與下AOZ在鯽魚體內的平均消除速率也存在顯著差異。其中對照組（A1）鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中 AOZ的平均消除速率為0.86、0.52、0.14 μg/(kg·h)；與對照組相比，恩諾沙星-呋喃唑酮組（A3）與磺胺間甲氧嘧啶-呋喃唑酮組(A4)鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中AOZ的平均消除速率均有不同程度的降低，分別為 0.36、0.31、0.03 μg/(kg·h)和 0.78、0.41、0.13 μg/(kg·h)，這可能是因為恩諾沙星及磺胺間甲氧嘧啶對鯽魚肝臟的肝微粒體酶活性產生了抑制作用，且兩種藥物對 AOZ消除的抑制能力不一樣。肝微粒體酶是藥物代謝過程中的催化劑[12]，它的主要成分是細胞色素 P450（CYP450），李國昌等[13]表明，CYP450酶在肝臟中的活性對藥物代謝起決定性作用，與藥物的清除率呈正相關。賈嫻等[14]分別單次及連續(xù)三天對鯽魚腹腔注射恩諾沙星 3 mg/kg、30 mg/kg，然后在給藥24 h后對鯽魚體內氨基比林 N-脫甲基酶（APD）、紅霉素 N-脫甲基酶（ERND）、7-乙氧基異吩噁唑酮-O-脫乙基酶（EROD）、7-乙氧基香豆素-O-脫乙基酶（ECOD）及苯胺-4-羥化酶（AH）進行活性測定，發(fā)現(xiàn)實驗組中這五組種肝藥酶活性明顯下降，恩諾沙星對鯽魚體內的肝微粒體酶具有抑制作用；丁同貴等[15]也指出磺胺類藥物能夠抑制肝藥酶活性，這與本實驗推論一致。

此外，與其他兩種抗生素參與下 AOZ消除速率的變化不同，土霉素—呋喃唑酮（A2）組鯽魚腎臟、肝臟、肌肉中 AOZ的平均消除速率與對照組相比明顯升高，分別為1.71、1.17、0.31 μg/(kg·h)，這可能與其殘留濃度的升高有關，但據(jù)臨床研究報道，土霉素對肝臟的肝藥酶也有抑制作用[16]，與本實驗結果不一致，可能是因為本實驗的給藥濃度太低，土霉素未對鯽魚的肝藥酶的活性產生影響。

表4 鯽魚組織中AOZ的平均消除速率Table 4 The average elimination rate of AOZ in crucian carp tissue

3 結論

綜上所述，AOZ在鯽魚體內難消除，且三種抗生素分別與呋喃唑酮聯(lián)合用藥下，AOZ在鯽魚體內表現(xiàn)不同的殘留消除規(guī)律，其中，土霉素能夠提高 AOZ在鯽魚體內殘留濃度；恩諾沙星雖然能減少 AOZ在鯽魚體內的殘留濃度卻使其代謝變慢，AOZ在鯽魚體內的殘留時間延長；磺胺間甲基嘧啶對 AOZ的殘留量和平均消除速率分別有增加和延緩的作用但影響不大。本實驗的聯(lián)合用藥是在低濃度下進行，三種抗生素在高濃度下與呋喃唑酮聯(lián)合使用對 AOZ殘留消除的影響還有待探討。本研究為水產品質量安全監(jiān)管和漁藥殘留研究提供了理論基礎。