梁藝馨，李潔，劉康書(shū)，蔡秋，朱明，戴唯，王緬，王興寧

（貴陽(yáng)海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州貴陽(yáng) 550081）

有機(jī)錫化合物用途十分廣泛，常用作聚乙烯薄膜的穩(wěn)定劑、室溫硫化過(guò)程的催化劑和船底的防污劑等[1]。有機(jī)錫類(lèi)化合物因其高效、持效期長(zhǎng)的特點(diǎn)作為殺菌和殺螨農(nóng)藥也廣泛用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，目前有機(jī)錫類(lèi)農(nóng)藥主要有三唑錫、三環(huán)錫、薯瘟錫（三苯基乙酸錫）、毒菌錫（三苯基氫氧化錫）和苯丁錫等，例如三唑錫可用以柑桔的殺螨劑，防治全爪螨等，薯瘟錫可用于防治馬鈴薯的晚疫病，提升產(chǎn)量，苯丁錫用于防治山楂、桃、蘋(píng)果等水果蔬菜種植過(guò)程中的各種植食性螨類(lèi)害蟲(chóng)。同時(shí)，有機(jī)錫類(lèi)化農(nóng)藥也會(huì)對(duì)生物體造成損害，屬劇烈神經(jīng)毒物，會(huì)導(dǎo)致中樞系統(tǒng)腦白質(zhì)水腫，使細(xì)胞能量利用中氧化磷酸過(guò)程受障，對(duì)胸腺和淋巴系統(tǒng)進(jìn)行影響，甚至還會(huì)引起糖尿病和高血脂等疾病[2]。若經(jīng)由呼吸道、消化道和皮膚黏膜進(jìn)入人體內(nèi)，還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，減弱機(jī)體對(duì)抗腫瘤和抗病毒感染[3]。鑒于有機(jī)錫類(lèi)農(nóng)藥對(duì)人體和環(huán)境造成的不良影響，國(guó)內(nèi)外相關(guān)部門(mén)已對(duì)其殘留量做出限制甚至禁用，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2019中對(duì)水果和蔬菜中有機(jī)錫類(lèi)化合物殘留量有明確規(guī)定，其中三唑錫限量范圍為0.1～2 mg/kg，三環(huán)錫0.1～0.3 mg/kg，薯瘟錫（三苯基乙酸錫）0.1～5 mg/kg，毒菌錫（三苯基氫氧化錫）0.1 mg/kg，苯丁錫0.5～10 mg/kg。國(guó)際方面，以日本為例，食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表規(guī)定，三苯錫在食物中的最大殘留限量為 0.02～0.2 mg/kg，苯丁錫限量0.05～20 mg/kg；歐盟農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，薯瘟錫和毒菌錫最大殘留量為0.1 mg/kg。

目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)食品中有機(jī)錫類(lèi)化合物的分析方法較多，常用的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[4-6]、氣相色譜法[7-10]、液相色譜-質(zhì)譜法[11-14]及氣相色譜-質(zhì)譜法[15-17]等。相較于液相色譜法和氣相色譜法，液相色譜-質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性，目前也是較為廣泛使用的檢測(cè)方法，但測(cè)定有機(jī)錫類(lèi)化合物時(shí)，能與液相色譜聯(lián)用的靈敏檢測(cè)器相對(duì)較少，不能有效克服因霧化引起的稀釋效應(yīng)從而使信號(hào)下降，而氣相色-譜質(zhì)譜法具有很好的靈敏度，且能分析多種有機(jī)錫形態(tài)，選擇性較好。與氣相色譜-單四極桿質(zhì)譜法（GC-MS）相比，對(duì)于基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜的食品，氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法具有更好的抗干擾性。目前有很多研究均采用外標(biāo)法檢測(cè)有機(jī)錫類(lèi)化合物，但尚未見(jiàn)到使用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定食品中有機(jī)錫類(lèi)農(nóng)藥殘留的文章，由于內(nèi)標(biāo)物與被測(cè)組分的峰面積比值不受進(jìn)樣量波動(dòng)的影響，使用同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定能在一定程度上消除了前處理方法所引起的誤差及基質(zhì)效應(yīng)，因此結(jié)果更為準(zhǔn)確。本文以四乙基硼化鈉作為衍生試劑，采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定果蔬食品中三環(huán)錫、薯瘟錫、苯丁錫等有機(jī)錫類(lèi)農(nóng)藥的殘留。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

7890B/7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；Allegra X-30R高速離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Turbo Vap LV氮吹儀，美國(guó)Biotage公司；230Volt振蕩器，美國(guó)Talboys公司；Milli-Q去離子發(fā)生器，美國(guó)Millipore公司；PB1502-L電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：三環(huán)錫（純度98%）、薯瘟錫（純度98%），購(gòu)自德國(guó) Dr.Ehrenstorfer公司，苯丁錫標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL，純度≥97%），購(gòu)自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心，三苯基錫-d15（純度 98.1%），購(gòu)自加拿大 C/D/N Isotopes公司。

正己烷、丙酮（色譜純），德國(guó)CNW公司；乙腈（色譜純），德國(guó)默克公司；四乙基硼化鈉（NaBEt4，純度98%），美國(guó)Stem chemicals公司；甲醇（色譜純），德國(guó)默克公司；冰醋酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PC/NH2-SPE固相萃取柱（1000 mg/6 mL），天津博納艾杰爾科技有限公司；無(wú)水硫酸鈉（農(nóng)殘級(jí)），北京百靈威科技有限公司；氯化鈉（農(nóng)殘級(jí)），成都西亞化工股份有限公司。

雪桃、油桃、柑桔、茄子、洋蔥等樣品購(gòu)于市面。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱(chēng)取三環(huán)錫、薯瘟錫有機(jī)錫類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品各0.1000 g，用丙酮溶解并定容至100 mL容量瓶，即配制成1000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；量?.0 mL苯丁錫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用丙酮稀釋并定容至10 mL容量瓶中，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱(chēng)取0.1000 g三苯基錫-d15于100 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)工作液：取1.0 mL三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用丙酮稀釋成1.0 mg/L備用。

基質(zhì)混合-三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)校正溶液：用丙酮稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入到1.0 mL樣品空白基質(zhì)提取液中，使系列標(biāo)準(zhǔn)校正液濃度分別為 50、100、200、500、1000 μg/L（含三苯基錫-d15500 μg/L）。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

稱(chēng)取5 g（精確到0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入500 μL濃度為1.0 mg/L三苯基錫-d15內(nèi)標(biāo)溶液，加入15 mL冰醋酸-乙腈（1:99，V/V），均質(zhì)提取2 min，加入5 g氯化鈉，振蕩30 min，5000 r/min離心5 min，取上清液于試管中，再加入15 mL冰醋酸-乙腈（1:99，V/V），重復(fù)上述操作，合并提取液，于35 ℃水浴中減壓濃縮至近干。加入1 mL甲醇溶解殘留物，氮?dú)獯抵? mL，轉(zhuǎn)移至15 mL試管中待衍生。

1.3.2 衍生

向上述提取液中加入 5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）及1 mL四乙基硼化鈉溶液（2 g/100 mL），手動(dòng)搖勻后旋渦器振振蕩衍生反應(yīng)25 min，加入2 mL正己烷提取衍生產(chǎn)物，混勻，5000 r/min離心5 min后取上清液，待凈化。

1.3.3 凈化

先用6 mL正己烷預(yù)淋洗PC/NH2-SPE固相萃取柱（柱內(nèi)填好約1.5 cm無(wú)水硫酸鈉），待溶液面降至無(wú)水硫酸鈉層時(shí)，將上述衍生的提取液轉(zhuǎn)移至PC/NH2-SPE柱，再用15 mL正己烷-丙酮（99:1，V/V）溶液洗脫，收集全部流出液，35 ℃下氮吹至近干，用正己烷溶解并經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾定容至1 mL，進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)校正液的衍生

分別取不同濃度相同體積的混合-三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)校正溶液于15 mL離心管中，加入5 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.5）及1 mL四乙基硼化鈉溶液（2 g/100 mL），手動(dòng)搖勻后振蕩衍生反應(yīng)25 min，然后加入2 mL正己烷提取衍生產(chǎn)物，混勻，5000 r/min離心5 min后取上清液，進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.4.1 氣相色譜條件

色譜柱：DB-5色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：260 ℃，不分流進(jìn)樣；載氣：氦氣（純度≥99.999%）；進(jìn)樣量：1.0 μL；程序升溫：初始溫度為 80 ℃，保持 1 min，以 20 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持 1 min，再以 5 ℃/min的速率升溫至280 ℃，保持10 min。

1.4.2 串聯(lián)質(zhì)譜條件

電子轟擊電離源（EI源）：傳輸線溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；碰撞氣體：氬氣；采用 MRM模式，每個(gè)化合物檢測(cè)兩對(duì)母離子-子離子。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采 用 MassHunter GC/MS Acquisition B.070.01.1805軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，采用 MassHunter Workstation Software B.07.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，圖表采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化試劑的選擇

有機(jī)錫類(lèi)農(nóng)藥極性較大、不易揮發(fā)，難以直接使用氣相色譜分析，因此需要先將其衍生為易氣化的全有機(jī)取代的化合物再進(jìn)行測(cè)定。常用的衍生方法主要有三種，一種是在酸性條件下利用硼氫化鈉或硼氫化鉀進(jìn)行氫化反應(yīng)[18]，缺點(diǎn)是衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定且容易揮發(fā)；第二種是采用格氏試劑在無(wú)水有機(jī)溶中進(jìn)行[19,20]，但該方法會(huì)產(chǎn)生有害氣體且需要分解多余的衍生試劑，操作較為繁瑣；第三種則是在水溶液中加入四乙基硼酸鈉直接進(jìn)行乙基化衍生[21,22]，該方法無(wú)需分解過(guò)量的衍生試劑，反應(yīng)過(guò)程也相對(duì)簡(jiǎn)單，形成的衍生物性質(zhì)也穩(wěn)定。本文分別使用了乙基溴化鎂和四乙基硼酸鈉作為衍生化試劑進(jìn)行比較，按1.4條件對(duì)5種相同濃度的有機(jī)錫進(jìn)行衍生，在相同條件下考察它們對(duì)衍生物峰面積的響應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖 1。結(jié)果表明使用四乙基硼酸鈉作為衍生劑時(shí)衍生物的峰面積更大，響應(yīng)積極，因此本實(shí)驗(yàn)選用四乙基硼酸鈉作為衍生劑，該條件下三唑錫會(huì)先水解成三環(huán)錫，三環(huán)錫的衍生物為三環(huán)己基乙基錫，內(nèi)標(biāo)物三苯基錫-d15與毒菌錫、薯瘟錫主要官能團(tuán)相同，水解成三苯錫，三苯錫的衍生物為三苯基乙基錫[23]，苯丁錫的衍生物為三（2-甲基-2-苯基丙基）乙基錫。

圖1 兩種不同衍生劑對(duì)衍生物響應(yīng)的峰面積Fig.1 Peak areas of different derivatization reagents on the derivatization products

2.2 四乙基硼化鈉配制溶液的優(yōu)化

四乙基硼化鈉成本較高，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易水解，一般用甲醇或水配制，因此有必要使用合適的配制方法。盧大勝[24]等研究表明 2%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液在半個(gè)月內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)降解和活性降低的情況，因此該配制方法得以廣泛使用，朱萌萌[25]等研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，三環(huán)錫、三唑錫和苯丁錫經(jīng) 2%四乙基硼化鈉水溶液衍生后的應(yīng)比經(jīng) 2%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液衍生的更高。由于三環(huán)錫和三唑錫的衍生物均為三環(huán)己基乙基錫，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上加入了三苯基錫的對(duì)比情況，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，經(jīng)2%四乙基硼化鈉水溶液衍生的6種有機(jī)錫類(lèi)化合物的響應(yīng)值全面高于經(jīng) 2%四乙基硼化鈉四氫呋喃溶液衍生的衍生物，有利于提高本次分析檢測(cè)的靈敏度。因此本實(shí)驗(yàn)選用2%四乙基硼化鈉水溶液作為衍生劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

圖2 四乙基硼化鈉溶劑對(duì)衍生化效率的影響Fig.2 Effect of NaBEt4solvents on derivatization efficiency of organo-tin compounds

2.3 衍生時(shí)間的選擇

圖3 有機(jī)錫化合物衍生時(shí)間對(duì)衍生效率的影響Fig.3 Effect of derivatization time on derivatization efficiency of organo-tin compounds

反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使有機(jī)錫分解，時(shí)間太短則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不夠完全。按照1.4條件對(duì)同一濃度的3種有機(jī)錫化合物使用四乙基硼酸鈉作為衍生劑進(jìn)行衍生，研究不同衍生時(shí)間下它們峰面積的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明衍生時(shí)間為 25 min時(shí)，除了苯丁錫不明顯外，其余2種有機(jī)錫衍生物的峰面積最大，衍生效果最好，因此本實(shí)驗(yàn)選擇衍生時(shí)間為25 min。

2.4 固相萃取柱的選擇

目前大多數(shù)食品中有機(jī)錫類(lèi)化合物的檢測(cè)方法中，選擇Florisil柱對(duì)試樣進(jìn)行凈化，考慮到果蔬食品基質(zhì)中干擾物大多是烷基酚類(lèi)小分子干擾物、脂肪酸和色素等大分子干擾物，結(jié)合PC/NH2-SPE柱凈化效果，特別是對(duì)于蔬菜水果等色素較高的樣品的前處理有良好凈化效果的特性，與Florisil柱凈化效果進(jìn)行對(duì)比。向雪桃試樣中加入1 mg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，提取并經(jīng)四乙基硼化鈉溶液衍生后，分別使用PC/NH2-SPE固相萃取柱和Florisil固相萃取柱進(jìn)行凈化，研究?jī)煞N不同固相萃取柱對(duì)三種衍生產(chǎn)物的峰面積響應(yīng)情況，結(jié)果如圖4。

圖4 不同固相萃取柱對(duì)凈化效果的影響Fig.4 Effect of cleanupfororgano-tin compounds between PC/NH2-SPE and Florisil

結(jié)果表明，相同條件下，試樣經(jīng)PC/NH2-SPE柱凈化，三環(huán)己基乙基錫、三苯基乙基錫和三(2-甲基-2-苯基丙基)乙基錫的峰面積響應(yīng)均大于經(jīng) Florisil凈化的結(jié)果，因此本次試驗(yàn)采用PC/NH2-SPE柱進(jìn)行凈化。

表1 內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法差異比較Table 1 Comparison of external standard method and internal standard method

2.5 內(nèi)標(biāo)法定量和外標(biāo)法定量差異比較

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g（精確到0.01 g）雪桃試樣于50 mL離心管中，分別加入500 μL濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)工作液，另取5 g（精確到0.01 g）試樣于50 mL離心管中，只加入500 μL濃度為1.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。兩組試樣均按照1.3提取、衍生和凈化后上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以看出，相較于外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)法測(cè)定試樣的回收率更好。使用加入三苯基錫-d15內(nèi)標(biāo)溶液，能夠反應(yīng)出有機(jī)錫類(lèi)化合物在前處理過(guò)程中的損失，因此本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定。

2.6 質(zhì)譜特征離子對(duì)的選擇

圖5 雪桃加標(biāo)MRM模式色譜圖Fig.5 MRM Chromatograms of three derivatization products

3種有機(jī)錫衍生物用電離源進(jìn)行 Q1全掃描（50～580m/z），得到全掃質(zhì)譜圖，選擇豐度較高，質(zhì)荷比合適的碎片離子作為母離子，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，從二級(jí)質(zhì)譜圖中選擇響應(yīng)較高的碎片離子作為子離子，最后改變碰撞電壓來(lái)進(jìn)行碰撞能量?jī)?yōu)化。3種有機(jī)錫衍生物的專(zhuān)利質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

在選定的儀器條件下，3種有機(jī)錫化合物的衍生物可以得到良好的分離效果，見(jiàn)圖5。

2.7 方法的線性范圍、檢出限和定量限

取50、100、200、500、1000 μg/L 5個(gè)質(zhì)量濃度的混合-三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)校正溶液，按2.5中條件設(shè)定進(jìn)樣1 μL，以標(biāo)準(zhǔn)校正液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表3。以S/N=3確定檢出限，以S/N=10確定定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示3種有機(jī)錫衍生物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998，三環(huán)錫、三苯基錫和苯丁錫衍生物的響應(yīng)在50～1000 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，檢出限分別為0.03×10-1、0.03×10-1和 0.12×10-1mg/kg，均能滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)限量要求。

表2 3種有機(jī)錫衍生物的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞能量Table 2 Retention time, monitoring ion pairs and collision energy of three derivatization products

表3 3種有機(jī)錫衍生物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficient, limit of determination (LOD) and limit of quantitation (LOQ) for three derivatization products

2.8 精密度和加標(biāo)回收率

向雪桃樣品中添加0.04、0.10、0.20 mg/kg的混合-三苯基錫-d15標(biāo)準(zhǔn)校正溶液，每個(gè)水平設(shè)置6個(gè)平行。將加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理，經(jīng)提取、衍生后凈化進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表 4。結(jié)果表明，本方法回收率范圍為81.64%～106.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.10%～6.30%。

表4 3種有機(jī)錫衍生物的添加回收率和精密度Table 4 Recoveries and relative standard deviations (RSD) of three derivatization products (n=6)

2.9 實(shí)際樣品檢測(cè)

取市售水果蔬菜共6個(gè)品種，按照1.3中方法處理并進(jìn)行氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5，均未檢出有機(jī)錫化合物。

表5樣品檢測(cè)結(jié)果Table 5 Sample test results

3 結(jié)論

本文采用四乙基硼化鈉衍生，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)法測(cè)定桃中有機(jī)錫類(lèi)農(nóng)藥殘留。該方法回收率范圍為 81.64%～106.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.16%～6.33%（n=6），三環(huán)錫、三苯基錫和苯丁錫的方法定量限分別為 0.10×10-1、0.09×10-1、0.39×10-1mg/kg，符合分析方法的要求，操作簡(jiǎn)單高效，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，且與外標(biāo)法測(cè)定有機(jī)錫類(lèi)農(nóng)藥殘留的方法相比，同位素內(nèi)標(biāo)法定量能在一定程度上消除基質(zhì)效應(yīng)，使測(cè)定結(jié)果更為準(zhǔn)確，可用于水果蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)錫類(lèi)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，并為其他食品中有機(jī)錫類(lèi)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提供依據(jù)。