韓梅，侯雪，賀光云，邱世婷，王悅涵，鄒平

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（成都），四川成都 610066）

（2.樂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川樂山 614200）

黃樟素（Safrole）又稱黃樟油素、黃樟腦，是一種植物毒素，天然存在于姜、肉桂等天然芳香植物和樟屬類植物中，是許多食用天然精油如黃樟精油、八角精油和樟腦油的主要成分[1,2]。黃樟素不溶于水，但很容易與氯仿，乙醚和其他非極性有機(jī)溶劑混合。黃樟素香味物質(zhì)屬于具有致癌性的烷基苯類化合物，近年來有研究表明，黃樟素能在肝組織中形成黃樟素-脫氧核糖核酸（DNA）加合物，食物中黃樟素的含量在0.5%以上時(shí)引起肝細(xì)胞瘤，對(duì)人體有一定的毒副作用，易誘發(fā)基因突變和肝損傷，甚至肝癌，是消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)的強(qiáng)致癌物[3,4]。攝入足夠劑量的黃樟腦可引起氧化應(yīng)激，在食品加工過程中對(duì)含黃樟素的食物可采取干燥或蒸煮方式來消除或降低黃樟素的含量[5,6]。另有研究表明，含有黃樟素的樹皮精油可對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖具有防腐作用[7]。

目前文獻(xiàn)報(bào)道黃樟素的檢測(cè)方法主要是通過氣相色譜法（Gas chromatography，GC）[8,9]，液相色譜法（Liquid chromatography，LC）[10]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[11]，氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[12-15]，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）[16-20]對(duì)黃樟素進(jìn)行分析檢測(cè)。其中大部分都是對(duì)香精香料和煙草進(jìn)行檢測(cè)的。而對(duì)于生姜中的黃樟素檢測(cè)僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)果中并未指明生姜中黃樟素具體含量[17]。目前我們國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)在食品中黃樟素檢測(cè)分析方法暫為空白。為了控制天然植物或精油中污染黃樟素，歐盟規(guī)定了天然食品中黃樟素的最高殘留水平，其中調(diào)味料及調(diào)味醬為25 mg/kg[21]。此外在我國(guó)，黃樟素屬于第一類易制毒化學(xué)品，屬于管制類化學(xué)品[22]，因此為保障我國(guó)食品安全，建立一種食品中黃樟素的分析方法是非常必要的。

本研究針對(duì)生姜基質(zhì)的復(fù)雜性，在優(yōu)化前處理?xiàng)l件及儀器參數(shù)的基礎(chǔ)上，建立固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生姜中黃樟素的方法，對(duì)方法的實(shí)用性進(jìn)行了驗(yàn)證，適用于生姜樣品中黃樟素的篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99.9%），迪馬公司產(chǎn)品；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所（天津）；氯化鈉（NaCl），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水，由 Milli-Q超純水儀制備；乙腈、甲苯、正己烷、丙酮均為色譜級(jí)試劑，美國(guó)Thermo Fisher Scientific有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四極桿氣相色-譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 GCMSTQ8040，日本島津公司；渦旋混勻器，德國(guó) IKA VORTEX3；TGL-16LM高速離心機(jī)，湖南星科科學(xué)儀器有限公司；AE240電子天平，瑞士Mettler公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA R60。

生姜樣品：采購于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)或生產(chǎn)基地。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配置

準(zhǔn)確稱取一定量的黃樟素標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解并定容于25 mL的容量瓶，配制質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存。再用丙酮稀釋成 2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。臨用時(shí)，移取適量的標(biāo)準(zhǔn)工作液用空白樣品基質(zhì)提取液配制系列濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取10.0 g試樣于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混勻2 min后加入3 g氯化鈉，渦旋混勻2 min，8000 r/min離心5 min。吸取5 mL上清液于10 mL比色管中。用5 mL乙腈-甲苯預(yù)洗固相萃取柱，棄去流出液。下接250 mL錐形瓶，放入固定架上。將5 mL待凈化試樣倒入固相萃取柱中，再用5 mL乙腈-甲苯溶液洗滌，并將洗滌液移入柱中，重復(fù)5次。收集上述所有流出液于250 mL錐形瓶中，40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。加入2.5 mL正己烷-丙酮復(fù)溶，用于測(cè)定。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

SH-Rxi-5SilMS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣（純度＞99.99%）；恒流模式，流速1.69 mL/min；進(jìn)樣方式不分流，進(jìn)樣量1.0 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃；程序升溫，50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升至125 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃保持1.5 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

表1 化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of compounds

接口溫度300 ℃，離子源溫度230 ℃；電離方式為電子轟擊電離源（EI），電子轟擊能量70 eV，掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；碰撞氣Ar；碰撞室壓力239 Pa。黃樟素的保留時(shí)間和特征離子見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

試驗(yàn)采用 SH-RXI-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），通用型色譜柱適用于半揮發(fā)物質(zhì)，酚類化合物，胺，溶劑殘留，濫用藥物，農(nóng)殘，溶劑殘留，PCB同系物等的分析，是一款惰性非常高的GC-MS低流失色譜柱，可耐溫度達(dá)350 ℃。實(shí)驗(yàn)過程中通過調(diào)整色譜參數(shù)，使儀器的靈敏度、穩(wěn)定性和分離效率均處于最佳狀態(tài)，并獲得滿意的分離效果。經(jīng)過多次試驗(yàn)，確定色譜升溫程序如1.5.1節(jié)所述。

2.2 質(zhì)譜優(yōu)化

按默認(rèn)儀器工作條件對(duì)黃樟素基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液采用全掃描模式進(jìn)行掃描，通過NIST譜庫檢索確定其保留時(shí)間；根據(jù)黃樟素的一級(jí)譜圖選取響應(yīng)值高、特征性強(qiáng)的離子作為母離子，然后采用產(chǎn)物離子掃描模式，將其母離子打碎以獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子。通過優(yōu)化碰撞能量對(duì)母離子進(jìn)行碰撞解離，選擇豐度值大、特征性強(qiáng)、靈敏度高的離子作為子離子。最后將選定的母離子對(duì)和子離子對(duì)在MRM模式下進(jìn)行檢測(cè)，其中響應(yīng)強(qiáng)度高一組離子對(duì)為定量離子對(duì)，其他為定性離子對(duì)。黃樟素EI-MS譜圖見圖1。因分子式中含有苯環(huán)基團(tuán)，二級(jí)碰撞過程中產(chǎn)生的質(zhì)荷比為77的碎片離子容易出現(xiàn)干擾情況，所以不選77的離子碎片為子離子。同時(shí)，生姜是一種基質(zhì)成分復(fù)雜的物質(zhì)，為確保準(zhǔn)確定性，本次試驗(yàn)選用多對(duì)離子定性定量。因而實(shí)驗(yàn)選用母離子m/z162，子離子m/z161、131、104、103。黃樟素基質(zhì)標(biāo)液總離子流色譜圖見圖2。

圖1 黃樟素的EI-MS譜圖Fig.1 EI-MS spectrum of safrole

圖2 黃樟素基質(zhì)標(biāo)液總離子流色譜圖(50 μg/kg)Fig.2 Total ion current chromatogram of safrole matrix standard solution (50 μg/kg)

2.3 前處理的優(yōu)化

本試驗(yàn)的樣品為生姜鮮樣，含水分。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈，乙酸乙酯，乙醇作為提取溶劑時(shí)生姜中黃樟素的提取效率。生姜中含有水分，乙醇提取目標(biāo)物后無法準(zhǔn)確定量。乙酸乙酯在提取過程中極易揮發(fā)，有刺激性氣味，回收效果也不顯著。乙腈有優(yōu)良的溶劑性能，對(duì)色素、脂肪等非極性成分的提取能力較弱，且對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的干擾性小，最適宜于萃取極性范圍較寬的多種農(nóng)藥。結(jié)果表明，乙腈的提取效率最高，乙腈干擾較之前兩種試劑也少，因此本實(shí)驗(yàn)最終選用乙腈作為提取劑。生姜是一種成分較復(fù)雜的基質(zhì)，有天然色素和姜辣素類物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)采用較為成熟的固相萃取技術(shù)凈化，選用Carb-NH2石墨化碳小柱，來除去基質(zhì)成分中的干擾。

圖3 三種方法平均回收率對(duì)比Fig.3 Comparison of average recovery rates of the three methods

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了三種前處理方法，Quechers法和傳統(tǒng)固相萃取[23]兩種方法以及本次試驗(yàn)所采用的改良方法。Quechers法速度上更快操作簡(jiǎn)單，但是回收率低，凈化效果不佳，干擾大；而傳統(tǒng)固相萃凈化較Quechers法更好，回收穩(wěn)定，但前處理過程，所需樣品量和提取試劑量都大，耗時(shí)長(zhǎng)，振搖效果不如渦旋、離心效果好，改進(jìn)后的方法比傳統(tǒng)的方法提取效率更高，更節(jié)約時(shí)間。三種前處理方法平均回收率見圖3。由圖可知，三種方法中，改良固相萃取方法回收更高。因此本試驗(yàn)采取離心和過柱相結(jié)合的方式對(duì)生姜中的黃樟素進(jìn)行提取。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）是復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的檢測(cè)中必需考慮的問題。考察基質(zhì)效應(yīng)通常采用下列公式[24]計(jì)算：

式中：Sm表示基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Sn表示溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

當(dāng)ME＞0時(shí)，表示基質(zhì)對(duì)待測(cè)物有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；ME＜0為基質(zhì)抑制效應(yīng)。|ME|≤20%，可認(rèn)為該基質(zhì)沒有基質(zhì)效應(yīng)；若其值在20%～50%之間，則表明該基質(zhì)有中等基質(zhì)效應(yīng)；若|ME|＞50%，則表明基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng)。本試驗(yàn)基于目標(biāo)物（0.1 mg/kg）在基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值（Sm）和在乙腈純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值（Sn），考察了黃樟素在生姜中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果為30.2%，為中等基質(zhì)效應(yīng)。為消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，本試驗(yàn)采取基質(zhì)標(biāo)液校準(zhǔn)匹配法。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取凈化后的基質(zhì)空白溶液配制成 0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）。將上述配制成的濃度系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照2.2.2所述GC-MS/MS儀器優(yōu)化條件上機(jī)檢測(cè)，以待測(cè)化合物定量離子的強(qiáng)度y為縱坐標(biāo)，濃度x（mg/L）為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到黃樟素的線性方程及相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明黃樟素在0.005～0.5μg/mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)的峰高呈良好線性關(guān)系（R2≥0.999），線性回歸方程為Y=774943.0X-1053.366。在空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)檢測(cè)，以 3倍信噪比（S/N≥3）計(jì)算該方法的檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N≥10）計(jì)算該方法的定量下限（LOQ）。黃樟素殘留的檢出限（LODs）為 0.42 μg/kg，定量限（LOQs）為 1.41 μg/kg。

2.6 方法的回收率

表2 黃樟素在生姜中的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 The average Recovery and relative standard deviation of safrole in ginger

不含黃樟素的空白生姜樣品中加入適量黃樟素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入5、25、50 μg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，按 1.4節(jié)進(jìn)行前處理，每個(gè)水平測(cè)定6次，對(duì)其測(cè)定值做回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）計(jì)算，其結(jié)果見表 2。結(jié)果表明：黃樟素的平均回收率為 107.8%～111.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.02%～2.38%。

圖4 陽性樣品總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of positive sample

圖5 陰性樣品總離子流色譜圖Fig.5 Negative sample total ion chromatogram

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本方法對(duì)采集的生姜樣品進(jìn)行黃樟素含量測(cè)定。因生姜基質(zhì)干擾較大，本次實(shí)驗(yàn)采用了三對(duì)離子碎片定量定性。圖4為生姜陽性樣品總離子流色譜圖。圖5為生姜陰性樣品總離子流色譜圖。結(jié)果表明：對(duì)151份生姜樣品（包含仔姜、老姜和腐爛姜）進(jìn)行黃樟素定性檢測(cè)，其中23份生姜樣品檢出黃樟素，檢出率為15.2%，最低檢出量為0.45 μg/kg，最高檢出量為1.3 μg/kg。即生姜樣品中是天然存在微量黃樟素的，遠(yuǎn)低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了固相萃取凈化結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)生姜中的黃樟素的分析方法。通過乙腈提取，高速離心機(jī)離心，過固相萃取小柱洗脫淋洗，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容檢測(cè)。通過考察該方法的性能參數(shù)，結(jié)果表明其線性范圍、檢測(cè)限、平均添加回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差等指標(biāo)均滿足生姜中黃樟素的快速、高效、準(zhǔn)確定性與定量分析，為生姜及其生姜制品中的黃樟素篩查提供技術(shù)支持。經(jīng)過對(duì)大量實(shí)際樣品，包含仔姜和老姜的測(cè)試，發(fā)現(xiàn)生姜中黃樟素含量并不高，生姜中的黃樟素并不能引起質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)。