趙書雪，劉苗苗，吉建成，盧思雨，徐麗麗**

（1.青島農(nóng)業(yè)大學山東省應用真菌重點實驗室，山東 青島 266109；2.青島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，山東 青島 266109）

側(cè)耳屬（Pleurotus） 食用菌隸屬于擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目（Agaricales） 側(cè)耳科 （Pleurotaceae）[1]。據(jù)報道，我國目前有36種側(cè)耳屬真菌，均有較高的蛋白含量、豐富的氨基酸組成[2]，具有較高的營養(yǎng)價值。側(cè)耳因其栽培方法簡便，投資小，見效快，效益高等優(yōu)點而被廣泛栽培[3]。

隨著食用菌馴化栽培技術的不斷發(fā)展，人們對野生食用菌資源的開發(fā)和利用有了新的認識，側(cè)耳屬多糖、蛋白具有增強免疫力，抗癌等功效[4]。通過對野生側(cè)耳進行馴化栽培研究，不斷探索野生菌株生長的環(huán)境條件，制定出適合野生菌株栽培的方案；不斷優(yōu)化野生馴化菌株栽培條件，改變其部分特性，逐漸成為適合本地栽培的人工栽培品種；并測定其子實體的營養(yǎng)成分，篩選出最適栽培方法，指導生產(chǎn)實踐。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

側(cè)耳屬菌株5271，由云南農(nóng)科院蘇開美老師于昆明境內(nèi)采集并贈送；側(cè)耳屬菌株1710，采自山東濰坊境內(nèi)的野生菌株經(jīng)組織分離純化得到。

1.1.2 供試培養(yǎng)基配方及制備

棉籽殼45%、木屑30%、玉米粉30%、麩皮10%、石膏3%，磷酸二氫鉀0.5%、尿素0.5%，糖1%[5]。栽培種培養(yǎng)基制備料水比為 1∶1～1∶1.8，配制30 kg栽培料，每袋裝約750 g，121℃滅菌2 h。

1.2 主要儀器

日立8900高速氨基酸分析儀：沈陽奇特爾科技有限公司；XSP-9CA顯微鏡：上海光學儀器一廠；MR23i離心機：法國捷安公司；DRP-9082恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；spctro art200分光光度計：美國威泰克公司；EP214C電子天平：奧豪斯國際貿(mào)易有限公司（上海）等。

1.3 菌種鑒定方法

1.3.1 菌絲性狀觀察

野生菌株采用組織分離法接種于PDA固體培養(yǎng)基上，將滅過菌的載玻片斜插到離菌塊2 cm處，置26℃恒溫培養(yǎng)箱中暗光連續(xù)培養(yǎng)[6]。待菌絲長至載玻片上，取載玻片于顯微鏡下觀察其菌絲結(jié)構(gòu)及有無鎖狀聯(lián)合。

1.3.2 菌絲體DNA提取及ITS驗證

采用Ezup柱式真菌DNA抽提試劑盒提取DNA，采用引物 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 進行PCR擴增[7]，得到的PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序。

1.4 側(cè)耳菌株5271、1710菌絲最適生長條件及栽培條件的優(yōu)化

1.4.1 菌絲最適生長溫度

取直徑為5 mm的菌株菌餅接種于PDA固體培養(yǎng)基中央，分別于18℃、22℃、26℃、30℃、34℃恒溫培養(yǎng)箱避光倒置培養(yǎng)，每組設置3個重復，連續(xù)培養(yǎng)5 d。釆用十字交叉法每天定時測量菌落直徑，計算不同溫度培養(yǎng)條件下菌絲生長速率，菌絲生長速率（V，mm·d-1）計算公式為：

式中：Φ為菌落平均直徑（mm），d為菌絲生長天數(shù)（d）。

1.4.2 菌絲最適生長pH

將 pH 設置為 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，共 5 個梯度，每組設置3個重復，分別倒置于最適溫度恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)，測定及接種方法同1.4.1。

1.4.3 子實體最適栽培培養(yǎng)基篩選

按照 1.1.2栽培培養(yǎng)基配方，分別培養(yǎng)菌株5271、1710，觀察其子實體栽培性狀（主要是結(jié)實性），并進行子實體出菇試驗，探索是否可以應用于實踐，指導實際生產(chǎn)。

1.5 子實體營養(yǎng)成分分析

1.5.1 子實體含水量測定

將新鮮子實體稱重后放入烘箱中，40℃～60℃烘干4 h～5 h，再升溫至60℃～70℃，烘干直至恒重，記錄數(shù)據(jù)。

1.5.2 子實體中氨基酸含量分析

利用日立8900高速氨基酸分析儀，參考GB 5009.124-2016食品安全國家標準食品中氨基酸的測定測定子實體中氨基酸的含量。

1.5.3 子實體中粗多糖含量測定

按照水提醇沉法[8]提取子實體多糖；按苯酚-硫酸法[9]測定多糖含量，按照NYT 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定標準繪制葡萄糖標準曲線，后根據(jù)標準曲線計算多糖含量。粗多糖提取液中的多糖提取率（T，%）的計算公式為：

式中：C為測定濃度（mg·mL-1）；D為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積（mL）；ω為稱取子實體粉末質(zhì)量（g）；0.9 為還原糖換算成多糖的系數(shù)[9]。

1.5.4 子實體中粗蛋白含量測定

子實體粗蛋白含量測定采用蛋白定量測試盒[10]測定，計算子實體中粗蛋白含量。

1.5.5 子實體中其他常規(guī)營養(yǎng)成分含量測定

參考GB 5009.90-2016食品中鐵的測定測定子實體鐵含量；GB 5009.92-2016食品中鈣的測定測定子實體中鈣的含量；GB 5009.86-2016食品中抗壞血酸的測定測定子實體VC含量；GB 1886.233-2016食品添加劑維生素E測定子實體VE含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株菌絲培養(yǎng)觀察及ITS鑒定

2.1.1 菌絲生長形態(tài)

將野生菌株5271、1710菌餅轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，菌絲生長情況如圖1、圖2所示。

由圖1、圖2可知，野生菌株5271氣生菌絲生長較發(fā)達，呈絨毛狀，菌絲尖端較為粗壯，顏色較白，邊緣生長整齊。野生菌株1710菌落呈絨毛狀，圓形，菌絲潔白，菌落正反顏色無差異，菌落邊緣較整齊，濃密。

2.1.2 野生菌株ITS鑒定

2株野生菌株ITS序列擴增電泳圖見圖3。

由圖3可知，野生菌株5271、1710通過ITS1和ITS4引物擴增后的堿基數(shù)約為700 bp。通過測序比對發(fā)現(xiàn)，菌株5271與肺形側(cè)耳Pleurotus pulmonarius有99%的相似性，菌株1710與紫孢側(cè)耳Pleurotus sapidus有99%的相似性。

2.2 培養(yǎng)條件篩選結(jié)果

2.2.1 溫度對2株菌絲生長的影響

菌株在不同溫度梯度培養(yǎng)5 d，各菌株菌絲生長情況見圖4，菌絲生長速率見圖5。

由圖5可知，菌株5271在26℃時，菌絲生長速率最快，菌絲稠密、潔白，菌絲邊緣生長整齊，在其他溫度時菌絲生長速率較慢。菌株1710在30℃時，菌絲生長速率最快，菌絲潔白、稠密，菌絲邊緣生長整齊，在34℃時，2菌株菌絲仍可生長，菌株1710菌絲生長速率比5271快，耐受溫度高。綜上所述，在試驗溫度梯度中，最適5271菌絲生長溫度為26℃，1710菌絲生長最適溫度為30℃。

2.2.2 pH 對 2 株菌絲生長的影響

2株菌株在不同培養(yǎng)基pH且置于最適生長溫度下培養(yǎng)5 d，菌絲生長情況見圖6，菌絲平均生長速率統(tǒng)計見圖7。

由圖6、圖7可知，2株菌株在pH為7條件下長勢均較好，在pH5～9均能生長；菌株5271菌絲邊緣整齊、菌絲較白；菌株1710菌絲潔白、邊緣整齊、稠密。可見pH對菌絲生長速率影響較小，菌株1710菌絲長勢優(yōu)于5271生長情況。綜上，2株菌株生長的最適pH為7。

2.3 2株野生菌株出菇試驗結(jié)果

2.3.1 野生菌株栽培培養(yǎng)基篩選結(jié)果

對結(jié)實性的考察主要是考察原基形成所需時間。菌株5271原基形成時間20 d，1710原基形成時間17 d，2株菌株從原基形成到采收第一茬需要約5 d。子實體出菇條件為溫度15℃～17℃、濕度85%，光照強度為600 lx[11]，2株菌菌絲在菌包中生長速度較快、形成原基時間短、出菇期間轉(zhuǎn)潮快、出菇持續(xù)時間長，此時菌株5271、1710生物學效率分別達 100.03%、105.97%。

2.3.2 菌株子實體特征

2株野生菌株人工培養(yǎng)出菇結(jié)果見8。

如圖8A所示，菌株5271菌蓋形狀呈扁半球形至平展，倒卵形至腎形或近扇形，大小5 cm～13 cm，顏色為白色、灰白色至灰黃色，表面光滑，菌肉白色，靠近基部稍厚；菌褶白色，延生，稍密，不等長；菌柄很短或沒有，白色有絨毛，后期近光滑，內(nèi)部實心至松軟。從圖8B看出菌株1710子實體菌蓋呈黑褐色，與菌株5271顏色完全不同，呈半球形，靠近基部稍厚，菌褶白色，延生；菌柄較長。

2.3.3 菌株孢子印及孢子形態(tài)觀察

菌株5271野生菌株孢子印及孢子形狀見圖9，菌株1710野生菌株孢子印及孢子形狀見圖10。

由圖9、圖10所示，菌株5271孢子印呈扁半球形，白色；孢子淺綠色，呈近梭形。菌株1710孢子印呈近圓形，顏色為白色；孢子淡黃色，呈近梭形。

2.4 子實體營養(yǎng)成分分析結(jié)果

2株子實體中營養(yǎng)成分含量見表1。

表1 2株子實體中營養(yǎng)成分含量Tab.1 Content of nutrients in two fruiting bodies

由表1可知，2株菌株營養(yǎng)成分含量存在差異，其中，菌株5271、1710子實體中粗多糖含量分別含有 12.47 g·100-1g-1、19.42 g·100-1g-1，均比文獻[12-13]報道高；菌株5271、1710子實體中粗蛋白質(zhì)含量分別為 13.14 g·100-1g-1、15.40 g·100-1g-1。測定的微量元素Fe、Ca含量均較高，菌株1710子實體中 Fe含量高達 173.78 mg·100-1g-1。菌株 1710子實體中VE含量高于5271子實體中的含量，兩者相差2.28倍。而菌株5271子實體中VC含量是1710的4.55倍。根據(jù)綜合分析，1710菌株有更高的營養(yǎng)價值。

2.5 菌株氨基酸含量分析結(jié)果

采用日立L8900型氨基酸自動分析儀測得了2株側(cè)耳屬菌株中17種氨基含量，包括賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、組氨酸8種必需氨基酸（EAA），天門冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、脯氨酸9種非必需氨基酸（NEAA）[14]，由于采用酸水解法使得色氨酸結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，試驗未測。與已報道的糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus） 子實體氨基酸含量為對比[15]，2株野生側(cè)耳與糙皮側(cè)耳中氨基酸含量見表2。

由表2可知，2株菌株中17種氨基酸含量均不同，其中，2株菌株中酪氨酸、苯丙氨酸含量相差較大，約1.3倍左右。與糙皮側(cè)耳子實體蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸等含量相差不大（胱氨酸未檢測），纈氨酸、酪氨酸、組氨酸、蛋氨酸含量相差較大。菌株5271子實體中氨基酸總量、EAA、NEAA氨基酸含量均高于1710子實體，與糙皮側(cè)耳相差不大。

表2 2株野生側(cè)耳與糙皮側(cè)耳中氨基酸含量比較Tab.2 Comparison of amino acid contents between two wild Pleurotus spp.pellucidum

3 討論

對野生菌種質(zhì)資源的采集和鑒定是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一項基礎性研究工作[15]，通過馴化篩選可得到更多的工廠化栽培菌種。目前對野外采集真菌主要通過形態(tài)、ITS等進行鑒定。通過對采集的野生菌種鑒定可知菌株5271為肺形側(cè)耳，1710菌株為側(cè)耳屬紫孢側(cè)耳。研究了菌株5271、1710菌絲生長的最適條件；通過栽培條件篩選試驗發(fā)現(xiàn)該2株菌株都具有優(yōu)良的栽培性狀。2株菌株子實體中粗蛋白、粗多糖、微量元素、VC、VE及氨基酸含量進行測定，綜合分析，發(fā)現(xiàn)1710子實體營養(yǎng)價值更高。試驗對野生側(cè)耳屬真菌的馴化栽培研究可為今后側(cè)耳屬真菌野生資源開發(fā)利用，新種質(zhì)資源的獲取及遺傳育種等提供理論依據(jù)。