王曉巖 劉芳芳 包海鷹
(1長春科技學院,吉林長春130600;2吉林農(nóng)業(yè)大學食藥用菌教育部工程研究中心,吉林長春130118)
糙皮側耳(Pleurotus ostreatus)又稱平菇,阿魏側耳(Pleurotus nebrodensis)又稱白靈菇,金頂側耳(Pleurotus citrinipileatus Sing)又稱榆黃蘑,三種真菌均隸屬于擔子菌門(Basidiomycota),傘菌綱(Agaricomycetes),傘菌目(Agaricales),側耳科(Pleurotaceae),側耳屬(Pleurotus)[1-4]。側耳屬真菌具有藥理活性,對人體具有養(yǎng)身保健作用,是一類良好的具有極大藥用潛質和食用價值的食用菌[5-6],側耳屬真菌具有豐富的營養(yǎng)物質,包括多糖、蛋白質、氨基酸、脂肪酸等,這些生物活性成分具有提高機體免疫力、延緩衰老、抗疲勞、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)血脂、化學預防[7-9]等重要作用。筆者以三種側耳子實體為材料研究其不同溶劑提取物的抗氧化活性,并測定了其水提物對小鼠血清中細胞因子表達水平,以評價其免疫功能。
糙皮側耳子實體、阿魏側耳子實體及金頂側耳子實體均由吉林農(nóng)業(yè)大學名優(yōu)參茸中心提供。
試驗動物:健康昆明小鼠110只,雌性,體重(22±2)g,年齡6~8周,由長春生物制品有限公司提供,許可證號:SCXK-(吉)2017-0075。
苦味酸購自安美實驗器材有限公司;胸腺肽腸溶片購自西安迪賽生物藥業(yè)有限責任公司;總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)及小白細胞介素2(IL-2)酶聯(lián)免疫試劑盒購自碧云天生物技術研究所;酶標儀(TECAN公司Nano Quant infinite 200PRO)。
取干燥的糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳子實體各300 g,粉碎后用1 L石油醚40℃、二氯甲烷50℃、乙酸乙酯55℃、甲醇60℃回流提取3次,減壓回收各有機溶劑,得石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇浸膏。
將1.3中得到的提取物分別用80%的乙醇配成濃度為0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL的溶液,參照文獻[11]的方法測定其DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除能力,根據(jù)文獻[12]的方法測定ABTS自由基清除能力。分別以相同濃度的BHT(抗氧劑264)和Trolox(托倫試劑)為對照。
水提物制備:將粉碎的糙皮側耳、阿魏側耳及金頂側耳子實體各150 g,加入1 L蒸餾水,65℃提取2 h,重復3次,合并濾液,減壓濃縮,冷凍干燥得水提物。小鼠分組及給藥:將110只小鼠分組,每組10只。將糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳水提物分別設高(12.5 mg/kg)、中(6.25 mg/kg)、低(3.125 mg/kg)3個劑量濃度(中劑量組根據(jù)人給藥量的體表面積與小鼠等效計量換算得到[14])。
小鼠血清中的 IL-2、IFN-γ、SOD和GSH-Px水平的影響:小鼠取血前一晚禁食不禁水,待眼球取血后,將離心備用的血清按照試劑盒說明書檢測待測指標,顯色終止后450 nm處測量OD值,繪制線性標準曲線,計算各項指標實際濃度并分析。
圖1 糙皮側耳提取物清除DPPH自由基能力
圖2 阿魏側耳提取物清除DPPH自由基能力
圖3 金頂側耳提取物清除DPPH自由基能力
圖4 糙皮側耳提取物清除ABTS自由基能力
2.1.1 各提取物對DPPH自由基清除作用
由圖1、圖2、圖3可知,糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳不同溶劑的提取物均有一定清除DPPH自由基能力。其中,在金頂側耳中,乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基能力最高,也是三種側耳屬所有試驗組中清除DPPH自由基能力最高的;甲醇提取物次之,二氯甲烷提取物較弱,石油醚提取物最弱。糙皮側耳與阿魏側耳的乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基能力也是各側耳屬中最高,石油醚層提取物在各側耳屬中最弱;糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳乙酸乙酯提取物在質量濃度為1.0 mg/mL時,DPPH自由基清除率分別達78.58%、81.79%和91.45%。金頂側耳的乙酸乙酯提取物IC50為0.172 mg/mL,清除效果明顯高于其他溶劑提取物,并且高于陽性對照;阿魏側耳乙酸乙酯提取物IC50為0.186 mg/mL,清除效果較明顯,效果弱于金頂側耳及陽性對照,但高于糙皮側耳(糙皮側耳乙酸乙酯提取物IC50為0.206 mg/mL)。
2.1.2 對ABTS自由基清除作用
由圖4、圖5、圖6可知,糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳相同提取物在相同濃度下對ABTS的清除能力相近,其中乙酸乙酯提取物的清除能力最強,糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳乙酸乙酯提取物在質量濃度為1.0 mg/mL時,ABTS自由基清除率分別為55.72%、56.37%和65.24%,糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳乙酸乙酯提取物IC50分別為0.636 mg/mL、0.581 mg/mL和0.472 mg/mL,其余溶劑提取物對ABTS清除率很弱,IC50均大于1 mg/mL。
結果表明,小鼠灌胃不同劑量的糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳水提物20 d后,金頂側耳水提物3個劑量處理的小鼠血清中IL-2表達水平明顯高于其他側耳屬的對應劑量及陽性對照;阿魏側耳高劑量處理的小鼠血清中IL-2表達水平高于糙皮側耳高劑量及陽性對照;糙皮側耳高劑量處理的小鼠血清中IL-2表達水平略低于陽性對照;但所有劑量均與陰性對照有極顯著差異。金頂側耳與阿魏側耳高劑量處理的小鼠血清中IFN-γ表達水平均高于陽性對照,糙皮側耳高劑量處理的小鼠血清中IFN-γ表達水平略低于陽性對照,但高于陰性。金頂側耳與阿魏側耳高劑量處理的小鼠血清中GSH-Px表達水平略高于陽性,糙皮側耳高劑量處理的小鼠血清中GSH-Px低于陽性組,但明顯高于陰性組。三種側耳不同劑量處理小鼠血清中SOD表達水平與陽性組相差無幾,但均高于陰性組。
圖5 阿魏側耳提取物清除ABTS自由基能力
圖6 金頂側耳提取物清除ABTS自由基能力
圖7 三種側耳屬水提液對小鼠血清中IL-2水平的影響
圖8 三種側耳屬水提液對小鼠血清中IFN-γ水平的影響
圖9 三種側耳屬水提液對小鼠血清中GSH-Px水平的影響
圖10三種側耳屬水提液對小鼠血清中SOD水平的影響
在清除DPPH自由基抗氧化能力中,糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳均有不同程度的抗氧化能力,并且在質量范圍內(nèi)均呈現(xiàn)一定的量效關系,其中糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳乙酸乙酯提取物對DPPH及ABTS的清除率最好。這三種側耳屬真菌能夠誘導IFN-γ、SOD和GSH-Px等細胞因子表達水平,其中金頂側耳水提物效果明顯,從而提高機體免疫力,可預防癌癥、高血壓、糖尿病等疾病的發(fā)生[15-16]。
因此,糙皮側耳、阿魏側耳與金頂側耳有開發(fā)為抗氧化產(chǎn)品或免疫功能產(chǎn)品的良好前景。