張 弛，呂雨澤，鄧?yán)?，孫 健，葛菁萍

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2微生物黑龍江省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

2,3-丁二醇(2,3-BD)是一種應(yīng)用化合物，被作為一種重要的化工原料，并且2,3-BD被航天、能源以及食品等多個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[1]。通常人們利用微生物以石油為底物的方式進(jìn)行生產(chǎn)2,3-BD被廣受歡迎，然而，現(xiàn)如今2,3-BD的生產(chǎn)含有不足之處：一是產(chǎn)量較低，二是2,3-BD的結(jié)構(gòu)十分特殊，利用化學(xué)法合成2,3-BD的成本很高，所以不能用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)[2]。近年來(lái)利用生物法來(lái)生產(chǎn)2,3-BD等產(chǎn)品受到人們的關(guān)注，同時(shí)在國(guó)內(nèi)外其研究與發(fā)展速度飛快[3]，優(yōu)勢(shì)在于其成本低廉，工藝技術(shù)簡(jiǎn)單，同時(shí)具有降低污染，保護(hù)環(huán)境的作用[4-5]。

在大自然中，有許多常見(jiàn)的菌種可以用來(lái)生產(chǎn)2,3-BD，包括克雷伯氏菌屬(Klebisellasp.)[6-7]、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)[8-9]以及酵母菌屬(Saccharomycessp.)[10]等。不幸的是，克雷伯氏菌屬和芽孢桿菌屬等被歸類為II類致病微生物，容易造成具有危害性的工業(yè)生產(chǎn)[11-12]。相比之下，釀酒酵母已經(jīng)被作為安全性較高的微生物，且具有2,3-BD生產(chǎn)能力[13-14]。這使得研究學(xué)者們將釀酒酵母作為生產(chǎn)2,3-BD的焦點(diǎn)。

但是，野生型釀酒酵母本身產(chǎn)生2,3-BD的能力有限，如果不加以人為干涉的話，還不具備進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。因此人們從改造釀酒酵母代謝途徑的角度出發(fā)，試圖通過(guò)阻斷其支路代謝途徑[15]、過(guò)表達(dá)關(guān)鍵酶基因的方式[16]，來(lái)提高2,3-BD的產(chǎn)量。在釀酒酵母細(xì)胞中，2,3-BD的合成途徑其一是通過(guò)丙酮酸在丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase/PDC)的作用下生成乙醛，乙醛在PDC催化下生成乙偶姻，最終乙偶姻在2,3-丁二醇脫氫酶(2,3-butanediol dehydrogenase/BDH)作用下生成2,3-BD。所以，乙偶姻成為2,3-BD合成途徑中重要的前體物質(zhì)[17-18]。本課題組前期已經(jīng)嘗試對(duì)丙酮酸脫羧酶1和丙酮酸脫羧酶5基因進(jìn)行了敲除，導(dǎo)致2,3-BD的產(chǎn)量明顯提升。那么，外源添加適當(dāng)濃度的物質(zhì)乙偶姻后，是否會(huì)繼續(xù)提高2,3-BD的產(chǎn)量以及菌株的生長(zhǎng)？本研究將利用上述的兩種突變株以及S.cerevisiaeW5和S.cerevisiaeW141原始菌株對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 試驗(yàn)菌株S.cerevisiaeW5和S.cerevisiaeW141，由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏。S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5，經(jīng)過(guò)前期構(gòu)建，其中W5-Δpdc1和W5-Δpdc5分別是敲除了丙酮酸脫羧酶1和丙酮酸脫羧酶5的基因工程菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，108°C高壓滅菌20 min；葡萄糖單碳源發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖80 g/L，YNB 3.4 g/L，蛋白胨 20 g/L，K2HPO43 g/L，KH2PO411.8 g/L，(NH4)2SO410 g/L，pH自然，108°C高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1OD值與細(xì)胞干重二者關(guān)系確定 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的4株菌株，接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，30°C，140 r/min，在600 nm處吸光度下，測(cè)定吸光值。根據(jù)吸光值，進(jìn)行梯度稀釋，將菌液稀釋成6個(gè)不同的濃度，進(jìn)行離心后，棄上清，加入適量無(wú)菌水，在再行離心處理，將樣品放入烘箱中烘干稱重。

1.2.2 乙偶姻最適添加量的確定 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的S.cerevisiaeW5/W5-Δpdc1/W5-Δpdc5/W141菌株，進(jìn)行接種培養(yǎng)，外源添加0、2、4、6、8、10、12、14 g/L乙偶姻至培養(yǎng)基中培養(yǎng)84 h，30°C，140 r/min，每12 h取樣，測(cè)定pH值、細(xì)胞干重(Dry Cell Weight，DCW)，利用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)葡萄糖的消耗量、2,3-丁二醇產(chǎn)量以及乙偶姻剩余量進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確定添加乙偶姻的最適量。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源添加乙偶姻方案的確立及候選菌株的確定

通過(guò)對(duì)S.cerevisiaeW5/W5-Δpdc1/W5-Δpdc5/W141乙偶姻產(chǎn)量和BDH酶活進(jìn)行檢測(cè)（圖1），發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeW5-Δpdc5的乙偶姻積累量和BDH酶活性均明星呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，并且在發(fā)酵60 h時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)的乙偶姻積累量為0.626±0.04 g/L，BDH酶活性為0.0257±0.003 U/mg。然而，原始菌株S.cerevisiaeW5的乙偶姻產(chǎn)量為0.110±0.02 g/L，BDH酶活性為0.0099±0.001 U/mg，同時(shí)S.cerevisiaeW5-Δpdc5的乙偶姻產(chǎn)量是野生菌株S.cerevisiaeW141產(chǎn)量(0.282±0.02 g/L)的2.2倍，BDH酶活性兩者一致。另外，研究發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeW5-Δpdc1的乙偶姻積累量呈現(xiàn)先上升后下降再上升的微弱趨勢(shì)，在發(fā)酵24 h時(shí)積累量最大為0.129±0.01 g/L；BDH酶活性同樣在24 h時(shí)達(dá)到最大值為0.0122±0.001 U/mg；同原始菌株S.cerevisiaeW5相比，乙偶姻積累量提高了17.3%，BDH酶活提高了23.2%，差異明顯。然而，野生菌株S.cerevisiaeW141的乙偶姻產(chǎn)量和BDH酶活性均高于S.cerevisiaeW5-Δpdc1。綜上所述，從乙偶姻產(chǎn)量和BDH酶活性隨發(fā)酵時(shí)間變化的趨勢(shì)可以看出，乙偶姻的量直接影響了BDH酶的活性，同時(shí)間接影響了2,3-BD的產(chǎn)量，最終研究確定外源添加乙偶姻的方案。

以上數(shù)據(jù)表明：第一，S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5的2,3-BD產(chǎn)量較比原始菌株S.cerevisiaeW5的都有所提高，并且乙偶姻的積累量也會(huì)提高，同時(shí)促進(jìn)了BDH酶的活性；第二，通過(guò)對(duì)S.cerevisiaeW141和S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5的比較發(fā)現(xiàn) ，S.cerevisiaeW141自身對(duì)乙偶姻的積累和BDH酶活性的作用，都是其作為2,3-BD出發(fā)菌株主要的優(yōu)勢(shì)。綜上所述，針對(duì)于S.cerevisiaeW5/W141的優(yōu)勢(shì)和S.cerevisiaeW5-Δpdc1/Δpdc5的不足之處，研究確定使用S.cerevisiaeW5/W141共同作為本實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)2,3-BD的出發(fā)菌株。

圖1 乙偶姻產(chǎn)量和BDH酶活檢測(cè)結(jié)果

2.2 OD值與細(xì)胞干重關(guān)系曲線

利用OD600nm值來(lái)測(cè)定菌體生物量，按照1.2.1的方法。根據(jù)OD600nm值與DCW具體關(guān)系分別為公式(1)～(2)，結(jié)果證明，S.cerevisiaeW5/W141菌株OD600nm值和細(xì)胞干重成正比例關(guān)系。

2.3 乙偶姻最適添加量的確定

將菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，外源添加0、2、4、6、8、10 g/L和0、2、4、6、8、10、12、14 g/L乙偶姻，30°C，140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，每隔12 h取樣，葡萄糖消耗情況（圖2）、2,3-BD產(chǎn)量和乙偶姻剩余量隨發(fā)酵時(shí)間的變化情況（圖3）。

由圖2可以看出，外源添加不同濃度的乙偶姻對(duì)S.cerevisiaeW141/W5，在代謝過(guò)程中，葡萄糖隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，而逐漸被消耗，則在24 h左右，葡萄糖均基本耗盡。

圖2 S.cerevisiae W5/W141的葡萄糖消耗量隨發(fā)酵時(shí)間變化的關(guān)系曲線

圖3 S.cerevisiae W5/W141的乙偶姻剩余量和2,3-丁二醇產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間變化的關(guān)系曲線

由圖3可以看出，外源添加不同濃度的乙偶姻對(duì)S.cerevisiaeW5/W141來(lái)說(shuō)，2,3-BD的產(chǎn)量隨著乙偶姻添加量的增加而不斷提高。對(duì)于S.cerevisiaeW141而言，當(dāng)外源添加8 g/L乙偶姻時(shí)，2,3-BD的產(chǎn)量達(dá)到1.56±0.04 g/L(72 h)，乙偶姻在72 h時(shí)消耗完全；當(dāng)外源添加10 g/L乙偶姻時(shí)，2,3-BD的產(chǎn)量達(dá)到2.17±0.01 g/L(72 h)，但乙偶姻并沒(méi)有完全被消耗，72 h時(shí)積累了1.07±0.01 g/L。對(duì)于S.cerevisiaeW5而言，當(dāng)外源添加12 g/L乙偶姻時(shí)，2,3-BD的產(chǎn)量達(dá)到2.49±0.02 g/L(72 h)；當(dāng)外源添加14 g/L乙偶姻時(shí)，2,3-BD的產(chǎn)量達(dá)到2.75±0.03 g/L(72 h)，但乙偶姻仍然沒(méi)有完全被消耗，72 h時(shí)積累了2.55±0.04 g/L。因此，從乙偶姻積累量上考慮，向S.cerevisiaeW5/W141分別添加12 g/L和8 g/L乙偶姻更適合作為后續(xù)試驗(yàn)的最適添加濃度。

2.4 乙偶姻對(duì)菌體活性的影響，通過(guò)菌體活性輔助說(shuō)明代謝流向改變的菌體作用

2.4.1S.cerevisiaeW141外源添加8 g/L乙偶姻對(duì)的菌體活性的影響 運(yùn)用細(xì)胞活性染色試劑PI對(duì)S.cerevisiaeW141/W141-8 g/L菌體進(jìn)行單染色。將不同時(shí)間段的熒光效果利用流式細(xì)胞儀對(duì)其檢測(cè)，F(xiàn)CM圖譜進(jìn)行熒光差異比較（圖4）。通過(guò)對(duì)橫坐標(biāo)（PI單染色）與縱坐標(biāo)（側(cè)向角散射）的對(duì)比來(lái)對(duì)菌體活性情況進(jìn)行分析（圖5）。

從圖中可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)PI染色比例有所提高，并且所有數(shù)據(jù)都相對(duì)集中，S.cerevisiaeW141/W141-8 g/L的變化趨勢(shì)大致相同，均在60 h時(shí)達(dá)到最大分別為1.3%和1.9%，然而，對(duì)于流式細(xì)胞儀每次所收集的一萬(wàn)個(gè)細(xì)胞而言，整體細(xì)胞活性幾乎沒(méi)有受到影響。

2.4.2S.cerevisiaeW5外源添加12 g/L乙偶姻對(duì)的菌體活性的影響 運(yùn)用細(xì)胞活性染色試劑PI對(duì)S.cerevisiaeW5/W5-12 g/L菌體進(jìn)行單染色。將不同時(shí)間段的熒光效果利用流式細(xì)胞儀對(duì)其檢測(cè)，F(xiàn)CM圖譜進(jìn)行熒光差異比較（圖6）。通過(guò)對(duì)比從而分析菌體活性情況（圖7）。

圖4 不同時(shí)間段流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

從圖中可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)PI染色比例呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢(shì)，所有數(shù)據(jù)都不太集中，與S.cerevisiaeW141/W141-8 g/L的變化趨勢(shì)大致相同，均在24 h時(shí)達(dá)到最大分為0.6%和0.9%。

2.5 電鏡觀察菌體形態(tài)

將處理后的樣品通過(guò)掃描電鏡觀察菌體外貌形態(tài)（圖8）?？梢钥闯?，當(dāng)S.cerevisiaeW141/W5在外源添加適量乙偶姻后，菌體表面圓滑平整，整體飽滿，無(wú)明顯變化。

3 結(jié)論與討論

本研究前期通過(guò)嘗試對(duì)丙酮酸脫羧酶的基因pdc1和pdc5進(jìn)行敲除，在外源添加乙偶姻后，最終導(dǎo)致2,3-BD的產(chǎn)量不高。Yu等[19]敲除S.cerevisiae中的adh1、adh3和adh5基因后進(jìn)行分批發(fā)酵，2,3-BD的產(chǎn)量達(dá)到2.29 g/L，與野生型S.cerevisiae相比，乙醇的產(chǎn)量降低31.25%，而2,3-BD的葡萄糖轉(zhuǎn)化率顯著提高，為0.113 g/g。但弊端是Δadh1、Δadh3、Δadh5會(huì)積累大量的毒性物質(zhì)乙醛，且還會(huì)生成一定量的乙醇[20]。而前期試驗(yàn)結(jié)果2,3-BD的產(chǎn)量不高，可能是因?yàn)榍贸酥行拇x的關(guān)鍵酶，所以，當(dāng)2,3-BD代謝流增強(qiáng)時(shí)，菌株產(chǎn)能卻減少了。因?yàn)樵卺劸平湍钢?，乙醛和丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙偶姻過(guò)程中，丙酮酸脫羧酶在其中起關(guān)鍵作用，所以當(dāng)丙酮酸脫羧酶基因被敲除后，導(dǎo)致關(guān)鍵酶的酶活降低，使乙醛和丙酮酸無(wú)法更多地轉(zhuǎn)化成乙偶姻，最終導(dǎo)致菌株產(chǎn)2,3-BD的能力下降[21]。所以在2,3-BD合成過(guò)程中，關(guān)鍵酶起著至關(guān)重要的作用。

圖6 不同時(shí)間段流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)釀酒酵母代謝路徑可知，乙醇、甘油和2,3-BD的合成途徑成為酵母菌代謝的三個(gè)主要支路[22]。因此，外源添加適當(dāng)乙偶姻后促使2,3-BD產(chǎn)量增加的同時(shí)，必定減少了乙醇或甘油合成過(guò)程中的碳源分配，這可能是因?yàn)樘砑舆m當(dāng)乙偶姻后，促進(jìn)了關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而使2,3-BD的產(chǎn)量有所提高，由于乙偶姻和2,3-BD之間的反應(yīng)是可逆的[23]，所以當(dāng)2,3-BD產(chǎn)量增加的同時(shí)也使丙酮酸到2,3-BD途徑中相關(guān)酶的活性增加，所以，碳源在乙醇和甘油合成途徑中減少的情況下，會(huì)導(dǎo)致最終的產(chǎn)量下降。同時(shí)，乙偶姻和2,3-BD的轉(zhuǎn)化與NAD＋與NADH之間的轉(zhuǎn)化具有偶聯(lián)關(guān)系[24]。Ehsani等[25]提出了增加供氧的策略，在敲除ilv2基因并過(guò)表達(dá)als、aldc和bdh1基因的S.cerevisiae中增加溶氧量，甘油積累減少的同時(shí)，葡萄糖合成2,3-BD的理論產(chǎn)量比厭氧條件下高20%。這說(shuō)明通過(guò)改變?nèi)苎跽{(diào)節(jié)氧化還原平衡對(duì)于生產(chǎn)2,3-BD具有重要意義。Kawai S等[26]將2-丁酮作為外源添加電子受體，使NADH的含量降低，使甘油的產(chǎn)量下降，但2,3-BD的產(chǎn)量明顯提高。Kim S等[27]發(fā)現(xiàn)NADH氧化酶可以將NADH氧化成NAD＋，為了降低NADH的濃度，在過(guò)表達(dá)als、aldc和bdh1的基因的S.cerevisiae過(guò)程菌株中外源表達(dá)乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中的NADH氧化酶，從而將甘油代謝流向2,3-BD，最終使2,3-BD的產(chǎn)量提高了23.8%。所以乙偶姻在被BDH催化生成2,3-BD的同時(shí)，也會(huì)受到NAD＋與NADH含量的影響[28]。

圖8 電鏡觀察結(jié)果

本研究將S.cerevisiaeW5/W5-Δpdc1/W5-Δpdc5/W141四株菌株進(jìn)行試驗(yàn)對(duì)比，挑選出S.cerevisiaeW5/W141最適合作為出發(fā)菌株來(lái)生產(chǎn)2,3-BD，發(fā)現(xiàn)S.cerevisiaeW5和S.cerevisiaeW141外源添加乙偶姻的最適濃度為12 g/L和8 g/L，且當(dāng)S.cerevisiaeW5最適添加量為12 g/L乙偶姻，且72 h時(shí)，2,3-BD的產(chǎn)量最大達(dá)到2.49±0.02 g/L，并且乙偶姻在發(fā)酵結(jié)束前消耗完全；S.cerevisiaeW141最適添加量為8 g/L乙偶姻，且72 h時(shí)，2,3-BD的產(chǎn)量最大達(dá)到1.56±0.04 g/L。當(dāng)外源添加適量乙偶姻后，2,3-BD的產(chǎn)量之所以會(huì)提高，是因?yàn)樵谡麄€(gè)代謝過(guò)程中，乙偶姻與2,3-BD二者處于同一條代謝流中，且乙偶姻作為生產(chǎn)2,3-BD重要的前體物質(zhì)，當(dāng)乙偶姻的濃度升高時(shí)，同時(shí)也會(huì)伴隨著最終產(chǎn)物的增加[29]。Brackman G等[30]利用異源過(guò)表達(dá)枯草芽孢桿菌的關(guān)鍵基因acoA和acoB，來(lái)增強(qiáng)乙醛轉(zhuǎn)化為乙偶姻的能力，構(gòu)建菌株進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，最終2,3-BD的產(chǎn)量得到提升。Kim S等[31]在S.cerevisiae菌株的基礎(chǔ)上，異源過(guò)表達(dá)B.subtilis中的alsS和alsD基因和內(nèi)源bdh1基因后進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，2,3-BD產(chǎn)量達(dá)到了29.1 g/L。理論上講，在抑制乙醇代謝流向并過(guò)表達(dá)2,3-BD合成途徑后，菌株可以利用葡萄糖經(jīng)丙酮酸、α-乙酰乳酸、乙偶姻合成2,3-BD，或經(jīng)丙酮酸和乙醛轉(zhuǎn)化成乙偶姻，最終合成2,3-BD。因此，說(shuō)明在代謝過(guò)程中，前體物質(zhì)的增加對(duì)產(chǎn)物的產(chǎn)量具有一定促進(jìn)作用。所以，本研究還可以做進(jìn)一步的優(yōu)化。通過(guò)代謝過(guò)程手段使工程菌株具備利用廉價(jià)原料（木質(zhì)纖維素和藻類）來(lái)合成2,3-BD，從而提高生產(chǎn)2,3-BD的能力，但是，該方法是否會(huì)影響菌株正常生長(zhǎng)，這些都是今后需要去研究的。綜上所述，本研究中選用S.cerevisiaeW5/W141作為出發(fā)菌株，通過(guò)外源添加適量乙偶姻，使2,3-BD產(chǎn)量得到了一定的提升，從而解決了單一釀酒酵母發(fā)酵2,3-BD產(chǎn)量低的問(wèn)題，也為微生物高產(chǎn)2,3-BD開(kāi)辟了新的空間。