高玉榮

（巢湖學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽合肥 238024）

0 引言

紅曲紅色素是紅曲霉（Monascus spp.） 在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種天然、安全的食品添加劑[1]。紅曲紅色素作為著色劑具有色調(diào)純正、色澤鮮艷、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等行業(yè)[2]。目前，紅曲紅色素主要是以大米為原料固態(tài)發(fā)酵后提取或液態(tài)深層發(fā)酵制取，成本相對(duì)較高。采用廢棄物制備酒糟[3-5]、糖蜜等廢棄物為原料制備紅曲紅色素鮮有報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

紅曲霉CICC40706，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 發(fā)酵原料

白酒糟，經(jīng)60 ℃干燥至恒質(zhì)量；麩皮，市售小麥麩皮；糖蜜，甘蔗糖蜜。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1） PDA 固體斜面培養(yǎng)基。稱取去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，加1 000 mL 蒸餾水，煮沸1 h，過(guò)濾，補(bǔ)水至1 000 mL 加瓊脂2%，pH 值5.4（用0.4 mol/L 乳酸調(diào)節(jié)），于121 ℃下滅菌20 min[6]。

（2） 種子培養(yǎng)基。豆餅粉添加量2%，玉米粉添加量5%，K2HPO4·3H2O 添加量0.1%，MgSO4·7H2O添加量1.5%，pH 值5.4，于121 ℃下滅菌20 min。

（3） 基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基。稱取干燥后的白酒糟，添加等質(zhì)量的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍瑵?rùn)料30 min 放入平皿中，用高壓蒸汽滅菌鍋于121 ℃下滅菌30 min。

1.1.4 儀器及設(shè)備

DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DNP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海三發(fā)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；HS-408 型中英文可編程恒溫恒濕箱，南京泰斯特試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；TU1810 型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析產(chǎn)品；LDZM-80KCS-Ⅲ型自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

挑取紅曲霉斜面菌種接入PDA 固體斜面培養(yǎng)基中，于30 ℃下恒溫培養(yǎng)6～8 d 進(jìn)行菌種活化。挑取活化后的菌種于種子培養(yǎng)基中，于30 ℃下，以轉(zhuǎn)速160 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.2 麩皮水解液的制備

將麩皮加4 倍（按質(zhì)量計(jì)） 水，于35～40 ℃下浸泡5 h，取上清液制成。

1.2.3 廢棄物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)

（1） 酸添加量對(duì)白酒糟發(fā)酵紅曲紅色素的影響。①加酸種類對(duì)發(fā)酵紅曲紅色素的影響。稱取20 g 干燥的白酒糟，添加20 g 用乳酸、乙酸、磷酸、鹽酸調(diào)pH 值6.0 的蒸餾水，攪拌潤(rùn)料30 min，放入平皿（φ90 mm），于121 ℃下滅菌30 min，冷卻，接種紅曲霉液態(tài)菌種10%，在溫度30 ℃，濕度90%恒溫培養(yǎng)10 d 后，60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定紅曲紅色素的色價(jià)。②潤(rùn)料水pH 值對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲的影響。稱取20 g 干燥的白酒糟，用最適酸將20 g蒸餾水的pH 值分別調(diào)至4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，攪拌潤(rùn)料30 min，放入平皿（φ90 mm），于121 ℃下滅菌30 min，冷卻，接種紅曲霉液態(tài)菌種10%，30 ℃，濕度90%恒溫培養(yǎng)10 d 后，于60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定紅曲紅色素的色價(jià)。

（2） 糖蜜添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲的影響。稱20 g干燥的白酒糟，用最適酸將20 g 蒸餾水的pH 值分別調(diào)至6.0，攪拌潤(rùn)料30 min，放入平皿（φ90 mm），于121 ℃下滅菌30 min，冷卻，接種紅曲霉液態(tài)菌種10%，于30 ℃下，濕度90%下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中每天補(bǔ)加質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0，1%，2%，3%，4%，5%的糖蜜水溶液1%，培養(yǎng)10 d 后，于60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定紅曲紅色素的色價(jià)。

（3） 麩皮水解液添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲的影響。稱取20 g 干燥的白酒糟，用最適酸將20 g 蒸餾水的pH 值調(diào)至6.0，攪拌潤(rùn)料30 min，放入平皿（φ90 mm），于121 ℃下滅菌30 min。冷卻至室溫，接種紅曲霉液態(tài)菌種10%，在溫度30 ℃，濕度90%下恒溫培養(yǎng)，每天補(bǔ)加質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0，2%，4%，6%，8%，10%的麩皮浸提液水溶液1%，培養(yǎng)10 d 后，于60 ℃下烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定紅曲紅色素的色價(jià)。

1.2.4 固態(tài)發(fā)酵紅曲色素培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為依據(jù)，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)，對(duì)固體發(fā)酵紅曲紅色素的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 紅曲紅色價(jià)的測(cè)定

參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.19—2015 進(jìn)行紅曲紅色素色價(jià)的測(cè)定[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸添加量對(duì)發(fā)酵紅曲紅色素的影響

2.1.1 加酸種類對(duì)發(fā)酵紅曲紅色素的影響

酸性環(huán)境有利于紅曲霉的生長(zhǎng)和紅曲色素的產(chǎn)生。因此，試驗(yàn)研究了白酒糟潤(rùn)料水中添加的酸性物質(zhì)對(duì)紅曲紅色素色價(jià)的影響。

酸種類對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的影響見圖1。

圖1 酸種類對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的影響

由圖1 可以看出，將用添加了乳酸的水進(jìn)行潤(rùn)料后，白酒糟中紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲紅色素色價(jià)最高，因此選擇適宜的加酸種類為乳酸。

2.1.2 潤(rùn)料水pH 值對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的影響

培養(yǎng)基的初始pH 值能影響紅曲霉等微生物的細(xì)胞質(zhì)膜和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響微生物的生長(zhǎng)和代謝[8]。因此，試驗(yàn)研究了潤(rùn)料水pH 值對(duì)紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)紅曲紅色素的影響。

潤(rùn)料水pH 值對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的影響見圖2。

由圖2 可以看出，潤(rùn)料水pH 值4.0～6.5 時(shí)，潤(rùn)料水pH 值對(duì)紅曲紅色素色價(jià)影響顯著，當(dāng)潤(rùn)料水的pH 值為5.5 時(shí)色價(jià)最高，因此確定適宜的潤(rùn)料水pH值為5.5。

2.2 糖蜜添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的影響

經(jīng)過(guò)了酒精發(fā)酵作用，殘留在白酒糟中的可發(fā)酵性糖的含量較低，為了促進(jìn)紅曲霉的快速生長(zhǎng)及紅曲紅色素的產(chǎn)生，試驗(yàn)研究了糖蜜對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素色價(jià)的影響。

糖蜜添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的影響見圖3。

由圖3 可以看出，添加糖蜜可提高固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的色價(jià)，當(dāng)糖蜜添加量為2%時(shí)，紅曲紅色素的色價(jià)達(dá)到最大，繼續(xù)提高糖蜜添加量，紅曲紅色素的色價(jià)不再提高。因此，廢棄物固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的適宜糖蜜添加量為2%。

圖3 糖蜜添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的影響

2.3 麩皮浸提液添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的影響

麩皮浸提液中含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、B 族維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，在白酒糟中添加麩皮浸提液可促進(jìn)紅曲霉的生長(zhǎng)和紅曲紅色素的產(chǎn)生，因此試驗(yàn)研究了在白酒糟固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加麩皮浸提液對(duì)紅曲紅色素的影響。

麩皮浸提液添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲色素的影響見圖4。

圖4 麩皮浸提液添加量對(duì)固態(tài)發(fā)酵紅曲色素的影響

由圖4 可以看出，麩皮浸提液添加量可顯著提高白酒糟固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的色價(jià)，當(dāng)麩皮浸提液添加量為6%，固態(tài)物料中紅曲紅色素色價(jià)達(dá)到最大，繼續(xù)提高麩皮浸提液添加量，紅曲紅色素色價(jià)不再提高。因此，麩皮浸提液的適宜添加量為6%。

2.4 廢棄物固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

以酒糟、麩皮和糖蜜等廢棄物固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的單因素試驗(yàn)為依據(jù)，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)。

白酒糟固態(tài)發(fā)酵紅曲正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，白酒糟固態(tài)發(fā)酵紅曲正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 白酒糟固態(tài)發(fā)酵紅曲正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

由表2 可以看出，各因素對(duì)廢棄物固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素色價(jià)影響的先后順序?yàn)樘敲厶砑恿浚緋H 值＞麩皮浸提液添加量，固態(tài)發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組合為A2B2C2，即培養(yǎng)基pH 值5.5，糖蜜添加量2.0%，麩皮浸提液添加量6.0%。

表2 白酒糟固態(tài)發(fā)酵紅曲正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 正交試驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)

因正交試驗(yàn)的最佳組合為A2B2C2，不在正交試驗(yàn)的9 組試驗(yàn)中，因此在最佳組合培養(yǎng)基pH 值5.5，糖蜜添加量2.0%，麩皮浸提液添加量6.0%的條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)。

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

由表3 可以看出，3 次固態(tài)發(fā)酵物料中紅曲紅色素色價(jià)的平均值為729.7 U/g，大于正交試驗(yàn)的所有9 組發(fā)酵試驗(yàn)，因此驗(yàn)證試驗(yàn)證明了培養(yǎng)基pH 值5.5，糖蜜添加量2.0%，麩皮浸提液添加量6.0%是固態(tài)發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基。

3 結(jié)論

（1） 通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了以白酒糟、麩皮和糖蜜等廢棄物為原料固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的影響，結(jié)果表明白酒糟以乳酸潤(rùn)料能顯著提高紅曲紅色素的色價(jià)，潤(rùn)料水的pH 值、糖蜜添加量、麩皮浸提液添加量對(duì)紅曲紅色素的色價(jià)影響顯著。

（2） 通過(guò)正交試驗(yàn)確定以白酒糟、麩皮和糖蜜等廢棄物為原料固態(tài)發(fā)酵紅曲紅色素的最佳培養(yǎng)基為以乳酸水溶液潤(rùn)料，培養(yǎng)基pH 值5.5，糖蜜添加量2.0%，麩皮浸提液添加量6.0%，在此條件下紅曲紅色素色價(jià)的平均值為729.7 U/g。