賴為檉 何韶錚 鄭新穎 蘇淇琛 呂國(guó)榮

早產(chǎn)兒由于肺表面活性物質(zhì)（pulmonary surfactant，PS）合成不足，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)未發(fā)育完善，常發(fā)生急性肺損傷，導(dǎo)致呼吸窘迫綜合征等疾病，是早產(chǎn)兒死亡的主要原因之一［1］。本課題組前期研究［2］證實(shí)在羊膜腔內(nèi)注射PS 可有效預(yù)防早產(chǎn)兒肺損傷，其原理是PS 通過胎兒宮內(nèi)呼吸運(yùn)動(dòng)進(jìn)入胎兒呼吸道，從而發(fā)揮作用。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)旨在探討將PS直接注入胎肺效果是否有更佳，以及該方法預(yù)防早產(chǎn)兒肺損傷的可行性和有效性。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康新西蘭孕兔15 只，體質(zhì)量4.0～5.0 kg，購(gòu)于泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（閩）2016-0001。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器

使用Supersonic Imagine Aixplorer 彩色多普勒超聲診斷儀，線陣探頭，頻率4～15 MHz；FEI 公司透射電鏡QUANTA 450。

三、實(shí)驗(yàn)方法

將孕兔隨機(jī)分為胎肺注射PS組（胎肺組）、羊膜腔內(nèi)注射PS組（羊膜腔組）及對(duì)照組，每組各5只（共15窩胎兔）。參照文獻(xiàn)［2-3］于妊娠第27 d 剖宮產(chǎn)術(shù)前1 h行超聲引導(dǎo)下穿刺（穿刺針22 G）：胎肺組每只胎兔肺內(nèi)注射0.1 ml PS，羊膜腔組每只胎兔羊膜腔內(nèi)注射0.1 ml PS（圖1），對(duì)照組每只胎兔羊膜腔內(nèi)注射0.1 ml生理鹽水；注藥后超聲觀察確認(rèn)藥物或生理鹽水彌散。術(shù)后1 h行剖宮產(chǎn)取出早產(chǎn)兔。

圖1 超聲引導(dǎo)下注射PS示意圖（箭頭示穿刺針）

每窩隨機(jī)選取2只早產(chǎn)兔記錄存活時(shí)間。剖出早產(chǎn)兔30 min 后，每窩隨機(jī)選取2 只行支氣管肺泡灌洗測(cè)量二棕櫚磷脂酰膽堿（DPPC）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量。取早產(chǎn)兔左肺下葉，行HE 染色觀察病理學(xué)改變，參照文獻(xiàn)［4］行肺組織病理?yè)p傷評(píng)分。取右肺下葉，使用透射電鏡觀察Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AECⅡ）超微結(jié)構(gòu)改變；取肺組織切片行免疫組化測(cè)量PS 相關(guān)蛋白-A（SP-A）表達(dá)水平并計(jì)算平均光密度，TUNEL 法檢測(cè)其細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡指數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD法；肺組織病理?yè)p傷評(píng)分以中位數(shù)（四分位距）表示，組間比較行Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，兩兩比較行Nemenyi 檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組一般情況、存活時(shí)間及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

各組早產(chǎn)兔均未見死胎和明顯結(jié)構(gòu)畸形，羊膜腔、胸腔及體表均未見出血等穿刺并發(fā)癥。與對(duì)照組比較，胎肺組和羊膜腔組早產(chǎn)兔存活時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，DPPC含量和SP-A表達(dá)水平均增加，肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和IL-6 含量均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與羊膜腔組比較，胎肺組早產(chǎn)兔DPPC 含量、SP-A 表達(dá)水平及IL-6 含量均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；兩組存活時(shí)間和凋亡指數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組早產(chǎn)兔存活時(shí)間和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較

表1 各組早產(chǎn)兔存活時(shí)間和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與羊膜腔組比較，#P＜0.05。DPPC：二棕櫚磷脂酰膽堿；SP-A：肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白-A；IL-6：白細(xì)胞介素-6

凋亡指數(shù)（%）11.26±4.32*15.61±3.90*27.56±7.00 20.63 0.000組別胎肺組羊膜腔組對(duì)照組F值P值存活時(shí)間（min）333.30±60.05*326.20±53.13*75.20±16.36 96.82 0.000 DPPC含量（μg/ml）93.96±17.53*#78.45±13.91*44.34±8.30 33.94 0.000 SP-A表達(dá)水平0.400±0.096*#0.280±0.070*0.140±0.047 18.48 0.000 IL-6含量（ρg/ml）31.47±5.13*#25.36±3.94*38.25±6.75 14.25 0.000

二、各組肺組織光鏡下表現(xiàn)比較

對(duì)照組肺損傷病理評(píng)分為5.67（4.67，7.50）分；肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡部分萎縮，充氣不均勻，肺泡隔較厚且厚薄不均，肺泡腔內(nèi)多見水腫液、滲出物及紅細(xì)胞。羊膜腔組肺損傷病理評(píng)分為2.25（1.67，3.04）分，胎肺組肺損傷病理評(píng)分為2.17（1.58，2.54）分，二者損傷程度均明顯小于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。羊膜腔組與胎肺組鏡下表現(xiàn)相似，肺泡結(jié)構(gòu)基本完整，擴(kuò)張較均勻，肺泡腔尚清晰，二者肺損傷病理評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

三、各組AECⅡ透射電鏡下表現(xiàn)比較

對(duì)照組板層小體數(shù)量顯著減少，排空現(xiàn)象明顯，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多見不規(guī)則擴(kuò)張、腫脹；羊膜腔組與胎肺組電鏡下表現(xiàn)相似，可見較豐富的板層小體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹少見。見圖3。

圖2 各組早產(chǎn)兔肺組織病理圖（HE染色，×100）

圖3 各組早產(chǎn)兔AECⅡ透射電鏡下觀（白色箭頭示板層小體）

討 論

早產(chǎn)兒由于出生過早，其PS含量不足且抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)未發(fā)育完善，易發(fā)生急性肺損傷，機(jī)制如下：①PS 含量不足導(dǎo)致肺不張、肺順應(yīng)性下降，氣體交換受限，隨后出現(xiàn)低氧血癥和代謝性酸中毒，從而使肺血管痙攣、血管內(nèi)皮受損，導(dǎo)致以IL-6 為主的細(xì)胞因子在炎癥過程中的表達(dá)［2］；②在適應(yīng)了胎兒期相對(duì)低氧的宮內(nèi)環(huán)境后，新生兒出生后暴露于空氣極易誘導(dǎo)大量活性氧自由基產(chǎn)生，而抗氧化系統(tǒng)尚不成熟的早產(chǎn)兒無(wú)法快速代謝過多的活性氧自由基，更易發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，直接影響細(xì)胞增殖、凋亡，繼而引起細(xì)胞死亡和氧化損傷［5-6］。新西蘭兔的肺發(fā)育過程與人類相似，在其總?cè)焉飼r(shí)間的85%～90%時(shí)行剖宮產(chǎn)可獲得早產(chǎn)動(dòng)物肺損傷模型［7］。

PS 是儲(chǔ)存于AECⅡ板層小體中的脂蛋白混合物，通過胞吐方式釋放并鋪展于肺泡內(nèi)面，起到降低肺泡表面張力、穩(wěn)定肺泡大小的作用。脂質(zhì)中含量最高的是磷脂酰膽堿，其活性狀態(tài)DPPC 是PS 主要生理作用的活性成分。SP-A在蛋白質(zhì)中表達(dá)量最豐富，是磷脂發(fā)揮功能的重要載體，具有抑制局部炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的合成及釋放、發(fā)揮免疫平衡的作用［8］。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)量DPPC 含量和SP-A 表達(dá)水平來(lái)反映早產(chǎn)兔肺中PS 含量，結(jié)果表明胎肺注射PS 和羊膜腔內(nèi)注射PS 均可有效提高早產(chǎn)兔肺內(nèi)DPPC 含量和SP-A 表達(dá)水平，降低肺損傷病理評(píng)分和凋亡指數(shù)，減少IL-6 含量的釋放，延長(zhǎng)早產(chǎn)兔存活時(shí)間。相對(duì)于羊膜腔組，胎肺組DPPC含量和SP-A 表達(dá)水平均更高（均P＜0.05），說(shuō)明超聲引導(dǎo)下宮內(nèi)微創(chuàng)給藥能將藥物更精準(zhǔn)地作用于目標(biāo)臟器，從而提高藥物的利用率。雖然本實(shí)驗(yàn)中胎肺組和羊膜腔組肺組織病理?yè)p傷評(píng)分和凋亡指數(shù)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與羊膜腔組比較，胎肺組病理?yè)p傷評(píng)分和凋亡指數(shù)均呈下降趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑橥迷绠a(chǎn)后30 min 的狀態(tài)，時(shí)間較短，隨著病程進(jìn)展，肺中PS含量更高的胎肺組急性肺損傷程度是否較羊膜腔組向更好的方向發(fā)展尚有待今后進(jìn)一步探究。

細(xì)胞凋亡是氧化應(yīng)激相關(guān)肺損傷的一個(gè)重要組織學(xué)特點(diǎn)，研究［9-10］表明高氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與肺損傷程度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，相較于胎肺組和羊膜腔組，對(duì)照組早產(chǎn)兔AECⅡ板層小體數(shù)量顯著減少，排空現(xiàn)象明顯，這是一種代償性表現(xiàn)，由于對(duì)照組早產(chǎn)兔肺PS 含量少，機(jī)體代償性加速釋放已合成的PS。對(duì)照組早產(chǎn)兔的AECⅡ內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多出現(xiàn)不規(guī)則擴(kuò)張、扭曲及腫脹，這是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的表現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)且嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡。研究［9］證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的凋亡途徑參與早產(chǎn)兒高氧肺損傷并發(fā)揮主要作用，其機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白57 和CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白表達(dá)增加有關(guān)。文獻(xiàn)［11］報(bào)道PS 應(yīng)用于早產(chǎn)兒不僅可通過改善肺通換氣功能、預(yù)防肺泡塌陷發(fā)揮治療作用，還可減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)程度，改善病情及臨床預(yù)后，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦與之一致。另外，本實(shí)驗(yàn)中胎肺組IL-6含量高于羊膜腔組（P＜0.05），但兩組早產(chǎn)兔均未見明顯并發(fā)癥，凋亡指數(shù)下降，胎肺組IL-6含量升高的原因可能是胎肺注射過程中對(duì)胎兔造成的應(yīng)激刺激和穿刺損傷。IL-6是機(jī)體急性應(yīng)激反應(yīng)中最敏感的一種標(biāo)志物，在受到疼痛刺激、手術(shù)創(chuàng)傷后短期內(nèi)可明顯升高［12］。本實(shí)驗(yàn)穿刺過程中胎兔亦存在胎動(dòng)增多、心率加快等生理反應(yīng)，若采用25 G 或更細(xì)的穿刺針可能減少該生理反應(yīng)。

綜上所述，羊膜腔內(nèi)和胎肺注射PS均可有效預(yù)防早產(chǎn)兔肺損傷。與羊膜腔內(nèi)注射PS相比，胎肺注射相同劑量的PS 效果可能更佳。隨著超聲介入技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和成熟，超聲引導(dǎo)下胎肺注射PS有望成為預(yù)防早產(chǎn)兒肺損傷的新方法。