呂 芹韓 立 丁生晨 郭克磊臧文華張 鵬卞 華*

(1.南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,河南 南陽 473061;2.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)學(xué)院,河南 南陽 473004;3.河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽 473004)

系統(tǒng)性硬化病是一種以皮膚增厚和纖維化為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病,隨著疾病進(jìn)展而累及多種內(nèi)臟器官(如心、肺、腎、消化道等),10 年累積生存率為66.3%～77.5%[1],女性發(fā)病率約為男性的3～4 倍,治療方法以抗炎、改善血循環(huán)、抑制纖維化、免疫抑制及調(diào)節(jié)等為主,但均難以根治。目前認(rèn)為,免疫學(xué)異常是系統(tǒng)性硬化病纖維化的一個重要因素,在其發(fā)病中起著主導(dǎo)作用[2],故從免疫調(diào)節(jié)角度開發(fā)有效的相關(guān)藥物是研究重點(diǎn)。

中醫(yī)認(rèn)為,系統(tǒng)性硬化病屬“皮痹” “皮痹疽” 等范疇,病位在絡(luò)脈,與肺、脾、腎密切相關(guān),以補(bǔ)肺健脾益腎治其本,化濁通絡(luò)治其標(biāo),具有療效好、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢。溫陽化濁通絡(luò)方是課題組以黃芪桂枝五物湯、二仙湯、補(bǔ)肺湯等為基礎(chǔ)創(chuàng)制而成的,前期發(fā)現(xiàn)該方能降低系統(tǒng)性硬化病患者外周血輔助性T 細(xì)胞17 (Th17) 細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17 水平,但其機(jī)制尚不明確[3]。Th17細(xì)胞參與機(jī)體免疫應(yīng)答,在系統(tǒng)性硬化病進(jìn)展和纖維化過程中發(fā)揮了重要作用[4]；白細(xì)胞介素-6 受體(IL-6R) 是白細(xì)胞介素-6 (IL-6) 促進(jìn)Th17 分化和增殖的重要因子,介導(dǎo)多種自身免疫性疾病的組織慢性炎癥反應(yīng),是治療系統(tǒng)性硬化病的潛在靶點(diǎn)[5-6]；微小核糖核酸-155 (miR-155)可通過調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育來介導(dǎo)自身免疫炎癥反應(yīng),并可調(diào)節(jié)機(jī)體IL-6 等細(xì)胞因子的分泌來調(diào)控Th17[7-8]。本實(shí)驗(yàn)將考察溫陽化濁通絡(luò)方對Th17 細(xì)胞增殖的影響,探討其調(diào)控miR-155/IL-6R 通路治療系統(tǒng)性硬化病的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃芪(產(chǎn)地山西)、黨參(產(chǎn)地山西)、山藥(產(chǎn)地河南)、熟地(產(chǎn)地河南)、淫羊藿(產(chǎn)地四川)、積雪草(產(chǎn)地云南)、桂枝(產(chǎn)地廣西)、白芥子(產(chǎn)地河南)、絲瓜絡(luò)(產(chǎn)地河南) 等溫陽化濁通絡(luò)組方藥材均購自河南省張仲景大藥房股份有限公司(南陽店),經(jīng)南陽理工學(xué)院張超云副教授鑒定為正品,均符合2015 年版《中國藥典》 項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。人Th17 細(xì)胞磁性分選試劑盒(批號18F91695)、T Cell Exp Medium 無血清培養(yǎng)基(批號19C100395A),購自加拿大Stemcell 公司；miRNA Isolation Kit,購自美國Omega Bio-Tek 公司；All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit,購自美國Genecopoeia 公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒(批號00591330)、LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒(批號1887047),購自美國賽默飛世爾公司；FastStart Universal SYBR Green qPCR 試劑盒(批號31598800),購自德國默克公司；miR-155 誘導(dǎo)劑agomir、miR-155 抑制劑antagomir,購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；PCR 引物、UNlQ-10 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒(批號E613KA8742),購自生工生物工程(上海)股份有限公司；人IL-6、IL6-R 一抗及Alexa Fluor? 488(AF-488) -羊抗鼠、Alexa Fluor? 647 (AF-647) -羊抗兔二抗,購自美國Proteintech 公司。

1.2 動物 Wistar 大鼠60 只,雌性,體質(zhì)量220～250 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,動物生產(chǎn)許可證號SCXK (京) 2016-0011,飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求。

1.3 儀器 ABI Veriti 96 W 梯度PCR 儀、ABI ViiA7 實(shí)時熒光定量PCR 儀,購自美國賽默飛世爾科技公司；CB160二氧化碳培養(yǎng)箱,購自德國Binder 公司；LSM800 激光共聚焦顯微鏡,購自德國蔡司公司。

2 方法

2.1 Th17 細(xì)胞分離 根據(jù)2013 年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲風(fēng)濕病學(xué)會聯(lián)合制定的系統(tǒng)性硬化病分類標(biāo)準(zhǔn)[9],選擇2018 年3 月至2019 年7 月在南陽市中心醫(yī)院治療的16 例系統(tǒng)性硬化病患者,男性2 例,女性14 例；平均年齡(51±13 歲)；腎臟受累者3 例,抗核抗體陽性者15 例。患者簽署知情同意書后抽取外周血,密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞(PBMC),Stemcell Th17 磁性分選試劑盒分離Th17 細(xì)胞,加到T Cell Exp Medium 無血清培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。本研究得到南陽市中心醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

2.2 含藥血清制備 60 只大鼠隨機(jī)分為空白組及溫陽化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組,每組15 只,空白組以等量生理鹽水灌胃,而溫陽化濁通絡(luò)方水煎濃縮至相當(dāng)于原生藥1.5 g/mL 后,分別按15、30、60 g/kg 劑量每天灌胃,連續(xù)7 d。各組于末次灌胃給藥后60 min 內(nèi)采血,分離血清,制備空白血清及不同劑量含藥血清,微孔濾膜過濾除菌,56 ℃下滅活30 min 后,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 含藥血清對Th17 細(xì)胞增殖的影響 調(diào)整Th17 細(xì)胞濃度為1×107/mL,根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道的方法,采用追蹤活細(xì)胞分裂增殖過程的無細(xì)胞毒性熒光染料CFSE(5 μmol/L),在37 ℃下標(biāo)記5 min,分為高、中、低劑量含藥血清組和空白血清組,加入不含ImmunoCult Hu CD3/CD28 T 細(xì)胞刺激劑的無血清T Cell Exp Medium 培養(yǎng)基,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),另設(shè)僅加入ImmunoCult Hu CD3/CD28 T 細(xì)胞刺激劑的陽性對照組。48 h 后收集細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17 細(xì)胞中CFSE 熒光強(qiáng)度,Flowjo分析Th17 細(xì)胞增殖指數(shù)。

2.4 含藥血清對Th17 細(xì)胞miR-155 表達(dá)的影響 Th17 細(xì)胞以1×105/mL 濃度接種24 孔板,37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。按照LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書,分別轉(zhuǎn)染miR-155 誘導(dǎo)劑agomir (誘導(dǎo)表達(dá)陽性對照)、miR-155 抑制劑antagomir (抑制表達(dá)陽性對照),另設(shè)miR-155 干擾陰性對照組。轉(zhuǎn)染6 h 后,各轉(zhuǎn)染組分別加入10%低、中、高劑量含藥血清以及空白血清,48 h 后棄上清,PBS 緩沖液洗滌,按照miRNA Isolation Kit 說明書操作步驟提取miRNA,采用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit 逆轉(zhuǎn)錄,并以RT-qPCR 擴(kuò)增miR-155,正向引物5′-GGGGGGTTAATGCTAATCGTG-3′,反向引物5′-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3′；內(nèi)參 RNAU6 正向引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸1 min,35 個循環(huán)。以RNAU6 為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計(jì)算各處理組miR-155 相對于對照組表達(dá)量的變 化,ΔΔCt=(Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因)處理組-(Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

2.5 含藥血清對Th17 細(xì)胞IL-6、IL-6R mRNA 表達(dá)的影響 Th17 細(xì)胞接種、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染、分組同上,轉(zhuǎn)染6 h 后各轉(zhuǎn)染組加入10% 低、中、高劑量含藥血清及空白血清,48 h后棄上清,PBS 緩沖液洗滌,按照UNlQ-10 柱式Trizol總RNA 抽提試劑盒說明書操作步驟提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,RT-qPCR 擴(kuò)增IL-6、IL-6R mRNA,IL-6 正向引物 5′-CCTGATCCAGTTCCTGCAGA-3′,反向引物 5′-GAACTCCTTAAAGCTGCGCA-3′；IL-6R 正向引 物 5′-GAATCTTGCAGCCTGATCCG-3′,反向引物 5′-GACCGTTCAGCCCGATATCT-3′。內(nèi)參基 因GAPDH 正向引 物5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′,反向引物5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′,擴(kuò)增條件及IL-6、IL-6R 相對于對照組表達(dá)量的計(jì)算方法同上。

2.6 含藥血清對Th17 細(xì)胞中IL-6、IL-6R 蛋白表達(dá)的影響 分組及Th17 細(xì)胞接種濃度同上,各組細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h 后棄去培養(yǎng)基,PBS 緩沖液洗滌,4%多聚甲醛固定5 min,PBS 緩沖液洗滌3 次,含0.5%Triton X-100 的PBS 通透10 min,含5%羊血清的PBS 室溫封閉1 h,按照說明書推薦比例加入IL-6、IL-6R 蛋白一抗,室溫下孵育1 h,0.01% Triton X-100/PBS 緩沖液洗滌3 次,加入與一抗對應(yīng)的AF488 或AF647 熒光標(biāo)記二抗,室溫下孵育1 h,含0.01% Triton X-100 的PBS 緩沖液洗滌3 次,DAPI 染細(xì)胞核5 min,PBS 緩沖液洗滌后滴加適量防熒光淬滅封片劑,在蔡司激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照,通過Zen 軟件分析各組蛋白表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料以() 表示,組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清對Th17 細(xì)胞的增殖抑制作用 與空白血清組比較,經(jīng)CD3/CD28 T 細(xì)胞刺激劑處理后Th17 細(xì)胞增殖指數(shù)升高(P＜0.01),而經(jīng)含藥血清處理后受到抑制(P＜0.01),并呈劑量依賴性,見圖1。

圖1 含藥血清對Th17 細(xì)胞增殖指數(shù)的影響

3.2 含藥血清對miR-155 表達(dá)的影響 miR-155 agomir 誘導(dǎo)前,含藥血清可劑量依賴性地抑制miRNA 155 表達(dá)(P＜0.01)；miR-155 agomir 誘導(dǎo)后,與空白血清組比較雖然miR-155 表達(dá)升高,但含藥血清仍可部分抑制miR-155 表達(dá)(P＜0.01)；miR-155 antagomir 抑制miR-155 表達(dá)后,與空白血清組比較,含藥血清組對其表達(dá)無明顯抑制作用(P＞0.05),表明miR-155 是含藥血清的潛在作用靶點(diǎn),見圖2。

圖2 miR-155 agomir 誘導(dǎo)前后含藥血清對miR-155表達(dá)的影響

3.3 含藥血清對IL-6、IL-6R mRNA 表達(dá)的影響 miR-155 agomir 誘導(dǎo)前,含藥血清可劑量依賴性地抑制IL-6、IL-6R mRNA 表達(dá)；miR-155 agomir 誘導(dǎo)后,與空白血清組比較,含藥血清組仍可抑制兩者mRNA 表達(dá)(P＜0.01)；miR-155 antagomir 抑制miR-155 表達(dá)后,與空白血清組比較,含藥血清組對IL-6R mRNA 表達(dá)無明顯抑制作用(P＞0.05),但仍劑量依賴性地抑制IL-6 mRNA 表達(dá),提示IL-6R 可能是miR-155 的靶基因,含藥血清可能直接通過后者對前者mRNA 進(jìn)行靶向調(diào)控,見圖3～4。

3.4 含藥血清對IL-6、IL-6R 蛋白表達(dá)的影響 與空白血清組比較,含藥血清組可劑量依賴性地抑制Th17 細(xì)胞中IL-6、IL-6R 蛋白表達(dá),兩者平均熒光強(qiáng)度降低(P＜0.05,P＜0.01)；miR-155 agomir 誘導(dǎo)miR-155 表達(dá)后,與空白血清組比較,含藥血清組仍對兩者蛋白表達(dá)具有一定抑制作用,平均熒光強(qiáng)度有一定程度的下降(P＜0.01)；miR-155 antagomir 抑制miR-155 表達(dá)后,與空白血清組比較,含藥血清組對IL-6R 蛋白表達(dá)無明顯抑制作用(P＞0.05),但仍可抑制IL-6 蛋白表達(dá)(P＜0.01),提示含藥血清對IL-6R 的調(diào)控可能與調(diào)控miR-155 有關(guān),見圖5～7。

圖3 miR-155 agomir 誘導(dǎo)前后含藥血清對IL-6 mRNA 表達(dá)的影響

圖4 miR-155 agomir 誘導(dǎo)前后含藥血清對IL-6R mRNA 表達(dá)的影響

4 討論

系統(tǒng)性硬化病致病因素眾多,包括遺傳、感染、血管異常、免疫異常等,目前認(rèn)為其主要發(fā)病機(jī)制為患者免疫系統(tǒng)受到致病因素干擾,使免疫細(xì)胞和淋巴系統(tǒng)失去正常功能。西醫(yī)治療系統(tǒng)性硬化病以藥物為主,但其療程較長,不良反應(yīng)較多,易造成患者肝腎功能損害及并發(fā)癥,依從性差,從而影響其長期療效[11]；中醫(yī)認(rèn)為,系統(tǒng)性硬化病屬于“皮痹” 范疇,早在《素問·痹論》中就有記載,積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),療效顯著,不良反應(yīng)少。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),在現(xiàn)代藥理研究中已證實(shí)其療效機(jī)制,如軟皮湯、溫陽除痹湯等在硬皮病模型小鼠中能抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原合成,在皮膚成纖維細(xì)胞中可通過抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、改善其促纖維化表型來發(fā)揮抗纖維化作用[12-13]；五痹膠囊能提高輔助性T 細(xì)胞的功能,降低免疫球蛋白表達(dá)[14]。

圖5 各組IL-6、IL-6R 蛋白表達(dá)的影響（400×）

圖6 miR-155 agomir 誘導(dǎo)前含藥血清對IL-6、IL-6R 蛋白表達(dá)的影響

課題組前期研究發(fā)現(xiàn),溫陽化濁通絡(luò)方可阻止系統(tǒng)性硬化病皮膚成纖維細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S 期,下調(diào)凋亡抑制蛋白survivin、細(xì)胞周期蛋白cyclin D1 mRNA 及蛋白表達(dá),具有促凋亡、抑制增殖作用,從而發(fā)揮其抗纖維化作用[15]；Ebrahimiyan 等[16]發(fā)現(xiàn),系統(tǒng)性硬化病患者外周血T 細(xì)胞中survivin 表達(dá)增高與成纖維細(xì)胞凋亡受抑、自身免疫反應(yīng)和纖維化密切相關(guān),miR-150-5p、miR-16-5p、miR-485-5p 與survivin 變異體(survivin-ΔEx3、survivin-2B、survivin-3B 等) 總表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；Sandhu 等[17]發(fā)現(xiàn),miR-155 高表達(dá)與B 細(xì)胞中cyclin D1、IL-6 表達(dá)增高密切相關(guān),進(jìn)而使B 細(xì)胞異常增殖,凋亡受到抑制,以上結(jié)果表明miR-155 及其他miR、IL-6 都可能參與了對survivin、cyclin D1 的調(diào)控,從而促進(jìn)系統(tǒng)性硬化病進(jìn)展。miR-155 可通過調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育來介導(dǎo)自身免疫炎癥反應(yīng)；在CD4+T 淋巴細(xì)胞分化為Th17 細(xì)胞的過程中,IL-6首先與其受體IL-6R 結(jié)合,激活非受體型蛋白酪氨酸激酶,進(jìn)一步啟動Th17 細(xì)胞因子IL-17 A/F 等反向相關(guān)基因表達(dá)[6],故抑制Th17 細(xì)胞異常增殖,靶向調(diào)控miR-155、IL-6 或IL-6R 是治療系統(tǒng)性硬化病的有效措施之一。

圖7 miR-155 agomir 誘導(dǎo)后含藥血清對IL-6、IL-6R 蛋白表達(dá)的影響

miR 是一種不編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)源性小分子RNA,通過完全或非完全互補(bǔ)于靶基因的3′-非編碼區(qū)域(UTR),在轉(zhuǎn)錄后水平降解靶mRNA 或阻礙其翻譯,參與調(diào)節(jié)各種生物過程,包括促進(jìn)免疫細(xì)胞的分化成熟、抗體產(chǎn)生、炎性介質(zhì)釋放、參與炎癥信號通路等[18]。Antagomir 是根據(jù)miR成熟體序列設(shè)計(jì),經(jīng)過特殊標(biāo)記與化學(xué)修飾的單鏈小RNA,通過與細(xì)胞內(nèi)的成熟miR 強(qiáng)競爭性結(jié)合,阻止miR與其靶基因mRNA 的互補(bǔ)配對,抑制miR 發(fā)揮作用；Agomir 是經(jīng)過特殊標(biāo)記和化學(xué)修飾的雙鏈小RNA,通過模擬內(nèi)源性的miRNA 來調(diào)節(jié)靶基因的生物學(xué)功能,本實(shí)驗(yàn)通過miR-155 antagomir、agomir 分別阻斷、模擬miR-155 表達(dá),探討溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清是否通過miR-155 靶向調(diào)控IL-6 和IL-6R 的表達(dá)。結(jié)果表明,miR-155 antagomir阻斷miR-155 表達(dá)后,雖然IL-6、IL-6R mRNA 和蛋白表達(dá)均受到抑制,但含藥血清仍能降低IL-6 mRNA 和蛋白表達(dá),表明對IL-6 的抑制可能部分地通過抑制miR-155 實(shí)現(xiàn)。而含藥血清對IL-6R 的抑制作用可能通過直接抑制miR-155實(shí)現(xiàn),這與miR 數(shù)據(jù)庫Targetscan 預(yù)測IL-6R 是miR-155 靶基因一致。

綜上所述,溫陽化濁通絡(luò)方可劑量依賴性地抑制Th17細(xì)胞的增殖和miR-155 表達(dá),從而發(fā)揮對系統(tǒng)性硬化病的免疫治療作用,其機(jī)制可能與抑制IL-6、IL-6R mRNA 和蛋白表達(dá)有關(guān),而對IL-6R 的抑制作用可能與靶向調(diào)控miR-155 表達(dá)有關(guān),但該方是否存在其他調(diào)控IL-6、IL-6R 通路的機(jī)制尚不明確,仍需作進(jìn)一步研究來證實(shí)。