王 倩， 呂 芹， 卞 華

(1.南陽理工學院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室 河南 南陽 473004； 2.南陽理工學院張仲景國醫(yī)國藥學院 河南 南陽 473004； 3.南陽醫(yī)學高等?？茖W校 河南 南陽 473061)

系統(tǒng)性硬化病(Systemic sclerosis, SSc)是一種病因不明的復雜結(jié)締組織疾病，具有多器官受累和異質(zhì)性臨床表現(xiàn)。該病的發(fā)生發(fā)展主要表現(xiàn)為3個典型的病理過程：自身免疫異常，血管損傷和纖維化。這3個病理過程并不是相互獨立的，目前認為疾病發(fā)展早期是以微血管損傷和炎癥等病理改變?yōu)槭紕右蛩?，其中微血管損傷誘導的炎癥和自身免疫反應直接或間接刺激成纖維細胞的活化，導致纖維化的發(fā)生[1]。截至目前，臨床上對于SSc的西醫(yī)治療方案主要是運用環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、D-青霉胺，以及抗TGF-β等抗體來調(diào)節(jié)免疫異常、改善微循環(huán)和抑制纖維化[2]。但是，長期服用這些藥物所帶來的副作用以及巨大的經(jīng)濟負擔，使得患者牢騷滿腹。與此同時，中醫(yī)藥在SSc的治療中顯示出令人驚喜的潛力。本課題組經(jīng)過十多年的臨床實踐和基礎(chǔ)研究，提出根據(jù)“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論治療SSc的新思路，并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)制溫陽化濁通絡方。本文就溫陽化濁通絡方治療SSc的研究進展作出闡述。

1 溫陽化濁通絡方治療SSc的理論基礎(chǔ)

中醫(yī)典籍無SSc的相關(guān)記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，SSc類似于中醫(yī)之“皮痹”?！吨T病源候論》表述曰：“風濕痹痛之狀，或皮膚頑厚，或肌肉酸痛……。此證由于素體氣血虛弱，衛(wèi)外不固，腠里不密，外感六淫之邪……，而成痹阻，致發(fā)熱關(guān)節(jié)酸痛，皮膚受損，則腫厚蒼白而為皮痹?！薄秼D人大全良方》認為：“脾肺氣虛，肌膚不仁，手足麻木?！薄豆沤駡D書集成醫(yī)部全錄卷二十》曰：“肺主秋，亦主皮，肺氣衰則三氣入皮，故名之曰皮痹”?！杜R證指南醫(yī)案》曰：“痹者，……皆由氣血虧損，腠理疏豁，風寒濕三氣得以乘虛外襲，留滯于內(nèi)以致濕痰、濁血流注凝澀而得之”。中醫(yī)學理論認為，肺與皮毛相表里，兩者相互影響，疾病也會相互傳變。另外，脾為后天之主，運化津液，充于皮膚。腎為先天之主，“西方生燥，燥生金，金生辛，辛生肺，肺生皮毛，皮毛生腎”，“皮毛潤澤則又能生養(yǎng)于腎”。由此可知，皮痹之疾雖在皮毛，但其病因與肺脾腎密切相關(guān)。其病機為本虛標實，本虛是肺脾腎之陽氣虛；標實是濁邪痰瘀，阻滯脈絡。因此，根據(jù)“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論，我們以溫補肺脾腎之陽、化濁通絡為原則，創(chuàng)制溫陽化濁通絡方(藥物組成：黃芪、黨參、淫羊藿、桂枝、積雪草、白芥子等)。其中，黃芪補氣固表，黨參補脾肺之氣，淫羊藿補腎陽，祛風濕，三者共為君藥；積雪草活血化瘀，白芥子溫通經(jīng)絡，去除濁邪，共為臣藥；桂枝等辛溫通絡是屬佐使之用。

2 溫陽化濁通絡方治療SSc的臨床研究

基于“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論的溫陽化濁通絡方已經(jīng)廣泛應用于臨床治療SSc，并顯示出令人滿意的治療效果。臨床研究結(jié)果顯示，溫陽化濁通絡方能夠顯著改善SSc患者的皮膚積分、疾病活動指數(shù)、關(guān)節(jié)功能積分、握力、齒距、指距，降低雷諾現(xiàn)象的發(fā)生次數(shù)，明顯改善FVC、DLco等肺功能指標[3,4]。經(jīng)溫陽化濁通絡方治療后，SSc患者血IgG、ESR均明顯下降[5]。另外，溫陽化濁通絡方還提高了SSc患者對強的松、青霉胺的耐受性，減輕其西醫(yī)治療的副作用[3]。這些研究結(jié)果表明，溫陽化濁通絡方能夠顯著改善SSc患者的生理機能、精神健康，提高患者生存質(zhì)量。

3 溫陽化濁通絡方治療SSc的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究

我們通過系列臨床研究已經(jīng)證實了溫陽化濁通絡方對于SSc具有良好的治療效果。中藥復方在疾病治療中能夠同時作用于多個靶點，這也是中醫(yī)藥的優(yōu)勢之處。但是，由于其成分復雜，也造成了中醫(yī)藥治療疾病的作用機制很難徹底明晰。因此，開展中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，分離中藥的有效部位或有效成分，既有助于理解中藥發(fā)揮作用的機制，又能夠在此基礎(chǔ)上對中藥進行優(yōu)化，保留有效成分的同時剔除有害物質(zhì)。在本課題組既往研究中，我們制備了溫陽化濁通絡方的水溶性部位、正丁醇部位、乙醚部位、乙醇部位、乙酸乙酯部位的不同溶劑提取物，通過小鼠遲發(fā)型超敏反應(DTH)模型分別探討其對SSc的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，溫陽化濁通絡方的水溶性部位和正丁醇部位能夠顯著抑制T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖，同時顯著改善DTH小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)[6]。因此，溫陽化濁通絡方對于SSc的免疫調(diào)節(jié)作用可能是其水溶性部位和正丁醇部位。

4 溫陽化濁通絡方治療SSc的作用機制

前期，本課題組通過離體細胞實驗和動物模型相結(jié)合，采用現(xiàn)代分子生物學、細胞生物學、免疫學、病理學等技術(shù)揭示了溫陽化濁通絡方治療SSc主要是通過以下4種作用機制來實現(xiàn)的。

4.1 調(diào)控Th17/Treg細胞失衡和B細胞活化

長期以來，SSc已經(jīng)被證實在發(fā)病過程中存在先天性和適應性免疫系統(tǒng)的異常，包括受累組織的慢性單核細胞浸潤、細胞因子和生長因子表達水平的失調(diào)以及自身抗體的產(chǎn)生。組織學研究表明，在 SSc 的早期階段，血管周圍炎癥浸潤伴隨著內(nèi)皮細胞損傷，炎癥滲出的主要細胞為巨噬細胞和T淋巴細胞。在眾多的T細胞類型中，輔助性 T細胞 17 (T help cell 17，Th17) 和調(diào)節(jié)性 T 細胞( regulatory T cells，Treg)與SSc發(fā)病的相關(guān)性最為密切[7]。Th17 細胞與 Treg 細胞的功能表現(xiàn)為相互拮抗，在正常人體內(nèi)兩者保持動態(tài)平衡，維持著正常的免疫應答反應。研究已經(jīng)證實，Th17/Treg細胞失衡是SSc發(fā)病的關(guān)鍵因素[8]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠遲發(fā)型超敏反應模型(DTH)中，溫陽化濁通絡方能夠明顯減輕 DTH 小鼠耳腫脹、降低小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)，抑制 T、B 淋巴細胞增殖[6]。另外，還發(fā)現(xiàn) SSc 患者外周血中 Th17 細胞比例、Th17/Treg 比值，以及血清IL17 的含量均高于健康人群，而 Treg細胞比例，以及血清 IL10 的含量低于健康人群。通過給予溫陽化濁通絡方治療，能夠顯著降低SSc 患者的 Th17 細胞比例、Th17/Treg比值，以及血清 IL17 的含量，同時上調(diào) Treg 細胞比例，以及血清IL10 的含量[9,10]。在體外實驗中，進一步研究表明，溫陽化濁通絡方抑制 Th17 細胞增殖的作用機制和miR-155/IL-6/IL-6R通路以及JAK2/STAT3信號通路有關(guān)[10,11]。這些研究結(jié)果表明溫陽化濁通絡方能夠通過調(diào)節(jié) SSc 患者 Th17/Treg 細胞失衡而發(fā)揮治療作用。

此外，在SSc患者和動物模型中，均發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞穩(wěn)態(tài)存在異常，其激活標記物，如CD80、CD95、HLA-DR、B 細胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)，在某些 B 細胞亞群(主要是記憶 B 細胞)和患者血液中表達上調(diào)[12]。在功能上，B淋巴細胞同T淋巴細胞一樣，兩者共同維持著機體正常的免疫耐受。因此，SSc患者體內(nèi)B淋巴細胞的異常活化與其自身免疫異常的形成密切相關(guān)。另外，B淋巴細胞還是 TGF-β 的來源并表達 TGF-β 的受體，而TGF-β是導致SSc纖維化形成的關(guān)鍵細胞因子之一[13]。本課題組的既往研究結(jié)果顯示溫陽化濁通絡方能夠抑制血清BAFF水平，進而降低SSc患者皮膚積分和疾病活動指數(shù)[5]，表明溫陽化濁通絡方能夠通過調(diào)控B細胞活性，發(fā)揮治療SSc的作用。

4.2 抑制成纖維細胞的激活和增殖

纖維化可在 SSc 的早期和晚期發(fā)生，幾乎可以發(fā)生在 SSc 的所有器官中，但在皮膚、肺、心臟和胃腸道中最為突出。纖維化過程依賴于成纖維細胞的過度活化、重編程和正常穩(wěn)態(tài)特性的喪失，導致它們在外周組織中轉(zhuǎn)化為增殖和代謝活躍的肌成纖維細胞。成纖維細胞的異常激活并轉(zhuǎn)化為表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌成纖維細胞是纖維化形成和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt-1蛋白和人皮膚成纖維細胞共同孵育，能明顯增加成纖維細胞 α-SMA mRNA和蛋白表達，刺激Ⅱ型膠原釋放，表明Wnt-1能誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化[15]。本課題組的既往研究顯示，溫陽化濁通絡方能夠顯著抑制Wnt-1誘導的成纖維細胞中α-SMA的表達水平，并且抑制其遷移能力[16]，表明溫陽化濁通絡方能夠抑制成纖維細胞的激活，進而發(fā)揮抑制SSc纖維化的作用。

纖維化除了與成纖維細胞的過度活化相關(guān)之外，SSc患者皮膚、肺、心臟和其他器官的組織學研究顯示成纖維細胞數(shù)量顯著增加，表明成纖維細胞的增殖與SSc纖維化的發(fā)生密切相關(guān)[17]。因此，抑制成纖維細胞的增殖和激活是治療SSc的策略之一。本課題組既往研究結(jié)果顯示溫陽化濁通絡方能夠阻止有絲分裂的成纖維細胞從G0期進入S和G2/M期[18]，表明溫陽化濁通絡方能夠通過調(diào)控細胞周期抑制成纖維細胞的增殖。進一步研究表明，在體外實驗中，溫陽化濁通絡方抑制成纖維細胞cyclin D1和survivin的表達水平，發(fā)揮促細胞凋亡和抑制細胞增殖的效應[19]。

4.3 調(diào)控細胞外基質(zhì)代謝

細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)主要由不同的膠原蛋白(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ和Ⅷ型)、糖胺聚糖(例如透明質(zhì)酸)、多糖和糖蛋白(例如纖連蛋白、多功能聚糖、雙糖蛋白聚糖、核心蛋白聚糖)組成。研究表明，SSc纖維化的發(fā)生發(fā)展與ECM的代謝密切相關(guān)，其機制主要為ECM生成和降解的動態(tài)平衡被打破，造成降解不足而合成相對過多，從而導致纖維化的發(fā)生[20]。成纖維細胞目前被公認為是ECM的主要來源細胞，正常情況下的成纖維細胞處于靜息狀態(tài)，而SSc患者成纖維細胞數(shù)目明顯增多，同時功能也存在過度活化現(xiàn)象。因此，數(shù)量過多和功能亢進的成纖維細胞產(chǎn)生了過量的ECM，最終導致了SSc纖維化的發(fā)生，故而抑制ECM的生成也是SSc治療的策略之一。上述已經(jīng)提到溫陽化濁通絡方能夠抑制成纖維細胞的增殖和激活，因此，我們可以推斷溫陽化濁通絡方能夠通過抑制ECM的生成發(fā)揮抗SSc纖維化的作用。這個推斷也已經(jīng)被我們的研究所證實，SSc動物模型和體外細胞實驗結(jié)果顯示溫陽化濁通絡方能夠抑制成纖維細胞中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、纖連蛋白的生成，改善SSc皮膚纖維化[21-23]。另外，我們的研究結(jié)果還揭示了溫陽化濁通絡方對膠原蛋白、纖連蛋白等ECM生成的調(diào)控是通過抑制結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)，TGF-β1/smad信號通路以及Wnt/β-catenin信號通路來實現(xiàn)的[22,24-26]。

溫陽化濁通絡方除了抑制ECM的生成之外，還能夠調(diào)控ECM的降解。正常情況下，ECM的生成和降解存在動態(tài)平衡，這是器官正常發(fā)育和修復的關(guān)鍵。ECM的降解主要是由金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)蛋白家族負責，其家族成員包括20多種。MMP 是鋅依賴性內(nèi)肽酶，能夠降解 ECM 的幾乎所有成分，尤其是ECM中的基質(zhì)結(jié)構(gòu)和膠原蛋白。除了MMP之外，體內(nèi)還存在大量金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)，可通過與基質(zhì)MMP-2結(jié)合，有效降低基質(zhì)MMP-2的活性，從而抑制 MMP-2 對 ECM 的降解。MMPs 及其天然抑制劑 TIMPs 始終處于動態(tài)平衡狀態(tài)，以維持組織中 ECM 的正常表達和沉積。然而，在SSc患者組織中，MMPs和TIMPs蛋白表達水平，以及MMPs/TIMPs比例存在異常，最終導致了ECM降解的失調(diào)，引起SSc纖維化的發(fā)生[27]。我們的既往研究顯示，溫陽化濁通絡方能夠顯著上調(diào)MMP-9水平和MMP-9/TIMP-1比值，同時降低TIMP-1的表達[25]。因此，溫陽化濁通絡方調(diào)控ECM的降解是其抗SSc纖維化的另一機制。TGF-β 能夠通過降低 MMP 和增加TIMP的表達來促進膠原沉積并抑制膠原降解[27]，因此溫陽化濁通絡方調(diào)控ECM的降解可能是通過抑制TGF-β信號通路實現(xiàn)的。

4.4 抑制血管內(nèi)皮細胞損傷，改善微循環(huán)

臨床癥狀和組織學數(shù)據(jù)表明，血管損傷和內(nèi)皮損傷是SSc最早的致病事件[28]?；罨膬?nèi)皮細胞能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，粘附分子，如血管細胞粘附蛋白1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、血漿細胞間粘附分子(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)和 E-選擇素(E-selectin)，以及趨化因子，如 MCP-1、MIP-1α 和 MIP-1β的表達，導致炎癥細胞的募集。內(nèi)皮細胞還產(chǎn)生內(nèi)皮素-1(Endothelin-1，ET-1)和CTGF，刺激血管平滑肌細胞增殖和ECM的產(chǎn)生。血管壁的逐漸增厚導致毛細血管腔變窄和微血管系統(tǒng)的功能失調(diào)，從而造成組織缺氧和氧化應激。此外，在 SSc 患者中還發(fā)現(xiàn)存在血管修復和血管生成功能缺陷，造成疾病的慢性進展。因此，保護血管，改善微循環(huán)是治療SSc的重要策略之一。在我們既往研究中，溫陽化濁通絡方能夠顯著改善SSc患者血管的管襻狀態(tài)、血管流態(tài)和襻周狀態(tài)積分。另外，經(jīng)溫陽化濁通絡方治療后，SSc患者血液中的循環(huán)內(nèi)皮細胞數(shù)量顯著減少[29]。這些結(jié)果表明溫陽化濁通絡方具有改善SSc患者甲襞微循環(huán)，保護血管的作用。

5 結(jié)論

綜上所述，基于“肺脾腎-皮毛”相關(guān)理論的溫陽化濁通絡方通過多水平、多途徑、多靶點發(fā)揮治療SSc的作用，具有堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。本文詳細總結(jié)了溫陽化濁通絡方治療SSc的研究進展，將有助于SSc的新藥開發(fā)，并為其他自身免疫疾病和纖維化相關(guān)疾病的治療提供參考。