卞華 徐艷琴 韓立 葉松山 陳麗平 張培華

【摘 要】目的：探討溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清對Wnt-1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及遷移的影響。方法：通過對Wistar大鼠灌胃制備溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清，體外培養(yǎng)正常人皮膚成纖維細(xì)胞，分為空白對照組、Wnt組和溫陽化濁通絡(luò)方組，作用24，48，72 h后，分別用RT-PCR和Western blot法檢測α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)，Transwell試驗檢測成纖維細(xì)胞遷移情況。結(jié)果：與空白對照組比較，Wnt組在不同作用時間下能誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)（P < 0.01），增加其遷移數(shù)量（P < 0.01）；與Wnt組比較，溫陽化濁通絡(luò)方組在不同作用時間下能夠顯著抑制Wnt-1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)（P < 0.05，P < 0.01），同時阻止其遷移（P < 0.01）。結(jié)論：溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清能抑制Wnt-1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及遷移，具有阻止或延緩系統(tǒng)性硬化病纖維化的潛能。

【關(guān)鍵詞】 系統(tǒng)性硬化?。粶仃柣瘽嵬ńj(luò)方；皮膚成纖維細(xì)胞；表型轉(zhuǎn)化；遷移；Wnt-1

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.08.001

【ABSTRACT】 Objective：To investigate the effects of Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription（溫陽化濁通絡(luò)方）on the phenotype transformation and migration of human skin fibroblast induced by Wnt-1.Methods：Medicated serum of Wistar rats was got by intragastric administration of Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription and normal human skin fibroblasts were cultured in vitro.The rats were divided into a blank control group，a Wnt group and a Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription group.Respectively after 24，48，72 hours，RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of α-SMA mRNA and protein，and Transwell was used to detect the migration of fibroblasts.Results：Compared with the blank control group，human skin fibroblasts a-SMA mRNA and protein expression in the Wnt group could be induced in different time（P < 0.01），and the number of migration increased（P < 0.01）.Compared with the Wnt group，human skin fibroblasts a-SMA mRNA and protein expression in the Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription group were obviously inhibited（P < 0.05，P < 0.01） and their migration were prevented（P < 0.01）.Conclusion：Medicated serum of Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription can inhibit the phenotype transformation and migration of human skin fibroblast induced by Wnt-1，having the potential to prevent or delay systemic sclerosis fibrosis.

【Keywords】systemic sclerosis；Wenyang Huazhuo Tongluo Prescription（溫陽化濁通絡(luò)方）；skin fibroblasts；phenotype transformation；migration；Wnt-1

系統(tǒng)性硬化?。╯ystemic sclerosis，SSc）是以膠原等細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積為特征的自身免疫性疾病，纖維化是SSc發(fā)病過程中最突出的特點，與其預(yù)后和死亡率密切相關(guān)[1]。前期研究表明，溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc具有較好療效[2]，同時溫陽化濁通絡(luò)方對博萊霉素誘導(dǎo)的SSc模型小鼠的皮膚硬化具有一定的抑制作用[3]。本研究運用血清藥理學(xué)方法，以人皮膚成纖維細(xì)胞為研究對象，觀察溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清對Wnt-1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及遷移的影響，進(jìn)一步探討其拮抗SSc纖維化的可能作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康雌性Wistar大鼠30只，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXL（京）2012-0001。

1.2 藥物與試劑 溫陽化濁通絡(luò)方煎劑由黃芪

30 g、黨參15 g，桂枝9 g、淫羊藿12 g、積雪草15 g、白芥子9 g等10味藥物組成，購于南陽理工學(xué)院附屬第一醫(yī)院，該方一劑共含生藥141 g，水煎，取濾液濃縮成含生藥2.5 g·mL-1。Wnt-1（美國Peprotech公司）；DMEM培養(yǎng)基、胰酶（美國Sigma公司）；胎牛血清、Trizol（美國Gibco公司）；α-平滑肌肌動蛋白（Alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗（美國Santa Curz公司）；化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑（美國Promega公司）。

1.3 實驗儀器 Ti-S型研究級倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Thermo 8000型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；ABI ViiA7型PCR儀（美國ABI公司）；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio Rad公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio Rad公司）；MR4100型酶聯(lián)免疫分析儀（美國Dynatech公司）等。

2 方 法

2.1 含藥血清的制備 選用30只雌性Wistar大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量遞增順序編號，參照隨機(jī)數(shù)字表將其分為空白組、溫陽化濁通絡(luò)方組，每組15只。溫陽化濁通絡(luò)方組以預(yù)試驗確定的10倍成人劑量溫陽化濁通絡(luò)方煎劑灌胃，空白組以等量生理鹽水灌胃。10 d后，分別于末次灌藥后30 min，運用心臟穿刺法采血，分離血清，然后采用斷頭法處死大鼠。采用HPLC-MS法測定藥物主要成分含量，制備含藥血清和空白血清。無菌分離血清，56 ℃滅活30 min后，-80 ℃冰箱保存，備用。

2.2 皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 在局麻及無菌條件下，切取2例女性整形外科患者上臂外側(cè)正常皮膚組織，入選者均知情同意。采用組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞[4]，倒置相差顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定，并對第2代細(xì)胞分別以角蛋白和波形蛋白單克隆抗體進(jìn)行免疫組化鑒定。3～6代細(xì)胞用于實驗，多余細(xì)胞放液氮中凍存，備用。

2.3 RT-PCR法檢測α-SMA mRNA表達(dá) 將處于對數(shù)生長期的正常人皮膚成纖維細(xì)胞分別接種于

24孔培養(yǎng)板，每孔含5×105個細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁后，換入無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實驗分3組：空白對照組（加終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%空白血清）、Wnt組（加2 ng·mL-1 Wnt-1 100 μL和終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%空白血清）、溫陽化濁通絡(luò)方組（加2 ng·mL-1 Wnt-1 100 μL和終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清），每組設(shè)3個復(fù)孔。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱，培養(yǎng)至24，48，72 h后，分別收集各組細(xì)胞，運用TrizoI試劑一步法提取人皮膚成纖維細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)合成cDNA后，取模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由北京賽百盛生物工程公司設(shè)計合成，序列分別為：α-SMA，上游5'-CGATAGAACACGGCATCATC-3'，下游5'-CATCAGGCAGTTCGTAGCTC-3'，擴(kuò)增長度316 bp；GAPDH，上游5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3，擴(kuò)增長度258 bp。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，退火40 s （溫度分別為54 ℃、62 ℃），72 ℃延伸40 s，72 ℃最后延伸10 min，30個循環(huán)。上述PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳約30 min，然后以凝膠成像儀紫外光下拍照，Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析，分別計算α-SMA mRNA與內(nèi)參GAPDH的灰度比值，得出相對表達(dá)量。

2.4 Western blot法檢測α-SMA蛋白 分別收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液裂解，冰浴30 min。4 ℃ 10 000 r·min-1的離心速度離心10 min，收集上清，用BCA蛋白檢測試劑盒進(jìn)行蛋白定量，-70 ℃保存。常規(guī)方法進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。按0.1 mL·cm-2加入封閉液，室溫封閉2 h后，依次加入一抗（1∶1000稀釋），室溫下輕搖2 h，4 ℃孵育過夜。棄去反應(yīng)液，用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min；加入二抗（1∶2000稀釋），37 ℃孵育1 h，用TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑對硝酸纖維素膜進(jìn)行顯色反應(yīng)，用電泳凝膠成像系統(tǒng)成像并對免疫印跡條帶進(jìn)行半定量分析，用β-肌動蛋白（β-actin）作內(nèi)參照，以與β-actin的比值表示各組蛋白表達(dá)水平。

2.5 Transwell試驗檢測成纖維細(xì)胞遷移情況

首先分別在細(xì)胞小室的上室和下室加入FN（50 g·mL-1）溶液進(jìn)行包被，將上室接種成纖維細(xì)胞每孔2×104個，在下室培養(yǎng)液中分別加入Wnt-1或Wnt-1加溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清。實驗分3組（同2.3），每組設(shè)3個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將上室取出，用棉簽去上室濾膜內(nèi)面細(xì)胞，對遷移至濾膜外的細(xì)胞，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的多聚甲醛固定，Giemsa染色，最后隨機(jī)選取4個視野（400×），在倒置顯微鏡下計數(shù)遷移過膜的細(xì)胞，取其均值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 溫陽化濁通絡(luò)方對Wnt-1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)的影響 與空白對照組比較，Wnt-1能誘導(dǎo)正常人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA的表達(dá)（P < 0.01）；與Wnt組比較，溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清在不同作用時間下能夠顯著抑制Wnt-1誘導(dǎo)的正常人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA的表達(dá)（P < 0.05，P < 0.01）。見圖1、圖2。

3.2 溫陽化濁通絡(luò)方對Wnt-1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的影響 Western blot法檢測顯示，與空白對照組比較，Wnt-1能誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA蛋白的表達(dá)（P < 0.01）；與Wnt組比較，溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清在不同作用時間下能夠顯著抑制Wnt-1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA蛋白的表達(dá)（P < 0.05，P < 0.01）。見圖3、圖4。

3.3 溫陽化濁通絡(luò)方對Wnt-1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞遷移的影響 人成纖維細(xì)胞遷移數(shù)量Wnt組（87.67±13.01）個與空白對照組（31.33±8.50）個比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；與Wnt組比較，溫陽化濁通絡(luò)方組成纖維細(xì)胞數(shù)量（57.33±12.01）個明顯減少（P < 0.01）。

4 討 論

成纖維細(xì)胞目前被公認(rèn)為是ECM的主要來源細(xì)胞，正常情況下處于靜息狀態(tài)，所以成纖維細(xì)胞的異常激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是纖維化形成和發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[5-6]，而α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)記性蛋白，可反映成纖維細(xì)胞表型改變。

Wnt/β-catenin信號通路與SSc纖維化密切相關(guān)，在成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，與正常人比較，SSc患者皮損成纖維細(xì)胞中β-catenin堆積，靶基因axin-2轉(zhuǎn)錄增加。在纖維化皮膚和肺組織中，Wnt-1和Wnt-10b表達(dá)增高[7]。動物實驗研究表明，Wnt-10b轉(zhuǎn)基因鼠表現(xiàn)皮膚增厚、皮膚纖維化、進(jìn)行性的皮下脂肪丟失、膠原蛋白堆積、成纖維細(xì)胞活化、肌成纖維細(xì)胞聚集等，同時皮膚成纖維細(xì)胞中有持續(xù)存在的Wnt/β-catenin信號，且高表達(dá)α-SMA，證實了Wnt/β-catenin信號誘導(dǎo)纖維化的能力[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt-1和人皮膚成纖維細(xì)胞共同孵育，能明顯增加成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實了Wnt-1能誘導(dǎo)靜止成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[9]。同時本研究還觀察到，Wnt-1能夠增加成纖維細(xì)胞的遷移，因此，抑制Wnt的產(chǎn)生和/或活性，拮抗或阻斷Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)，可以在SSc纖維化治療中發(fā)揮重要作用[10]。

中醫(yī)學(xué)無SSc病名，就其發(fā)病和臨床表現(xiàn)而言，應(yīng)屬“皮痹”或“皮痹疽”等范疇。筆者突破SSc發(fā)病多是“風(fēng)寒痹阻，寒凝血瘀”的傳統(tǒng)認(rèn)識[11]，基于肺脾腎-皮毛相關(guān)理論，以黃芪桂枝五物湯、補(bǔ)肺湯等為基礎(chǔ)方創(chuàng)制溫陽化濁通絡(luò)方。該方中黃芪補(bǔ)氣益衛(wèi)固表；黨參補(bǔ)益脾肺之氣；淫羊藿補(bǔ)腎壯陽，祛風(fēng)除濕，故重用為君藥。積雪草活血化瘀；白芥子溫通經(jīng)絡(luò)，善散“皮里膜外”之痰，祛除濁邪，俱為臣藥。桂枝等辛溫通絡(luò)屬佐使之用。諸藥相伍，通補(bǔ)并用、標(biāo)本兼顧，具有補(bǔ)肺健脾益腎、化濁通絡(luò)之效，共奏扶正祛邪之功。溫陽化濁通絡(luò)方能有效改善SSc患者皮膚積分、雷諾現(xiàn)象及甲襞微循環(huán)，降低血漿內(nèi)皮素、FVC、DLco等水平，治療SSc效果顯著。體外實驗表明，溫陽化濁通絡(luò)方能阻止SSc皮膚成纖維細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而控制細(xì)胞分裂，抑制其增殖[12]。動物實驗表明，溫陽化濁通絡(luò)方能夠干預(yù)硬皮病模型小鼠TGF-β1/Smad信號通路中TGF-β1、Smad2和Smad7 mRNA的表達(dá)，降低皮膚COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白含量，拮抗SSc纖維化[3]。

本研究從Wnt/β-catenin信號通路角度觀察溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清對人皮膚成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及遷移的影響，結(jié)果表明，溫陽化濁通絡(luò)方含藥血清能夠減少Wnt-1誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細(xì)胞α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)，抑制其遷移，提示溫陽化濁通絡(luò)方可阻止靜止成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，減少其聚集，具有阻止或延緩SSc纖維化進(jìn)行性發(fā)展的潛能。然而，由于Wnt/β-catenin信號通路與其他信號通路存在交叉對話，溫陽化濁通絡(luò)方如何調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路需進(jìn)一步深入研究。

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收稿日期：2015-06-10；修回日期：2015-07-27