劉 過，劉松濤，董安憶，楊亞桐，段會軍

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/華北作物種質(zhì)資源教育部重點實驗室，河北 保定 071000）

玉米是重要的糧食作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)占據(jù)重要地位。干旱是制約玉米高品質(zhì)豐產(chǎn)的主要原因，在不同程度上限制了植物的生長發(fā)育，導(dǎo)致植物的分子、細胞、器官和個體水平發(fā)生不利變化，如水平衡在植物中受到破壞，導(dǎo)致老葉枯黃，新葉萎蔫生長緩慢，活性氧清除系統(tǒng)紊亂，激素分泌紊亂 等［1］。同時，植物對干旱協(xié)迫做出有利的應(yīng)激反應(yīng)，首先通過傳遞干旱脅迫信號來調(diào)控抗旱基因的表達，然后合成一系列調(diào)控植物生長的蛋白質(zhì)。這些脅迫調(diào)節(jié)反應(yīng)反映在形態(tài)變化、氣孔調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除等方面，但干旱脅迫的響應(yīng)機制往往需要多種機制的協(xié)同作用［2］。玉米在喇叭口期生長發(fā)育最旺盛，對肥水條件最敏感，這一階段水分的缺乏會導(dǎo)致雄穗發(fā)育不良，雌穗分化受阻，導(dǎo)致每穗粒數(shù)嚴重減少，最終影響后期產(chǎn)量［3］。因此，研究V12（玉米12 葉齡）時期玉米響應(yīng)干旱脅迫差異表達蛋白，對揭示玉米V12 時期抵御干旱的調(diào)控機理有重要意義。

2001 年，真正意義上有關(guān)玉米的蛋白質(zhì)組學(xué)研究正式開始［4］，包括玉米不同器官/組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，玉米不同器官間相互關(guān)系的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，玉米細胞器蛋白質(zhì)組學(xué)分析，玉米脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。近20 年來，國內(nèi)外玉米蛋白質(zhì)組學(xué)進行了大量研究，主要集中在玉米不同組織及生物或非生物脅迫。本研究采用iTRAQ 技術(shù)，以耐旱性不同的玉米雜交種為材料，比較干旱脅迫下V12 時期玉米葉片蛋白質(zhì)水平上的差異，分析與響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)的差異蛋白的特性及生物學(xué)功能，初步揭示玉米在V12 時期抵御干旱脅迫的分子機理，為玉米抗旱育種及品種改良進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與干旱處理

試驗在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)清苑實驗基地抗旱棚內(nèi)進行，以玉米雜交種‘農(nóng)單476’和‘眾信978’為試驗材料，于2018 年6 月15 日播種于河北保定清苑抗旱棚。雜交種‘農(nóng)單476’是由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米改良中心育成的國審品種，‘眾信978’是由河北眾信種子科技有限公司選育省審品種。由河北農(nóng)林科學(xué)院旱作所鑒定‘農(nóng)單476’為抗旱品種，‘眾信978’為敏感品種。小區(qū)面積25 m2，行間距0.6 m， 株距0.3 m，雙粒穴播，水旱區(qū)1 m 防水墻間隔。各小區(qū)底肥均為復(fù)合肥512 kg/hm2。當75%的玉米植株長到8 葉時（7 月18 日）開始干旱處理，采用TZS-1 土壤水分測定儀（浙江拓普科技有限公司）對地下1 m 土壤相對含水量進行監(jiān)測，每20 cm 測量1 次。對照組控制田間土壤含水量20%～30%，處理組控制田間土壤含水量5%～10%。到12 葉時（7月30 日）取長勢相近的玉米的旗葉葉尖部分五厘米左右液氮速凍，3 個生物學(xué)重復(fù)，然后儲存在-80 ℃ 超低溫冰箱用于進行進一步分析。

1.2 總蛋白提取

利用冷丙酮法［5-6］從兩個玉米雜交種的試驗組和對照組的葉片組織中提取總蛋白，每個樣品設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 蛋白酶解與iTRAQ 標記

分別取蛋白樣品100 μg，加入蛋白溶液至100 μL， 加入2 μL 1μg/μL 胰酶和500 μL 100 mmol/L TEAB 緩沖液，混勻，37 ℃下酶切過夜。加入相同體積的1%甲酸，混勻，室溫12 000 r/min 離心5 min。取上清，緩慢通過C18 脫鹽塔，用1 mL 清洗液（0.1%甲酸，4%乙腈）連續(xù)3 次。加入0.4 mL 洗脫液（0.1%甲酸，45%乙腈）連續(xù)2 次。洗脫液樣品混合后，冷凍干燥。加入20 μL 0.5 mmol/L TEAB 緩沖液再次溶解，加入足夠的iTRAQ 標記試劑溶于異丙醇中，室溫下倒置攪拌1 h。加入100 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH=8)停止反應(yīng)，等體積標記后取樣并混合、脫鹽和冷凍干燥。多個標記組時取所有樣品進行等質(zhì)量蛋白混合作為標記組間的共同參照樣品。

1.4 SCX 分級與LC-MS/MS

采用L-3000 高效液相色譜系統(tǒng)進行強陽離子交換（SCX）色譜分離iTRAQ 標記的肽混合物。詳細步驟參考本實驗室已發(fā)表論文［7］。采用Q 型精密TM HF-X 質(zhì)譜儀，易構(gòu)建TM 離子源，設(shè)置離子噴射電壓為2.3 kV，離子傳輸管溫度320 ℃，質(zhì)譜儀采用數(shù)據(jù)相關(guān)采集方式，質(zhì)譜掃描范圍為m/Z 350 ～1 500，一級質(zhì)譜儀分辨率為60 000(200 m/z)， C-trap 的最大容量為3×106，C-trap 的最大注入時間為20 ms，用高能碰撞劈裂HCD 法選擇離子強度在全掃描范圍內(nèi)前40 位的母離子進行裂解，并用二次質(zhì)譜法進行檢測。二次質(zhì)譜的分辨率設(shè)定為15 000 (200 m/z)，C-trap 的最大容量為1×105，C-trap 的最大注入時間為45 ms，肽片段的碰撞能量設(shè)定為32%，閾值強度設(shè)定為8.3×103，排除的動態(tài)范圍設(shè)定為60 s，產(chǎn)生質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索質(zhì)譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫的選擇是生物信息后續(xù)分析的關(guān)鍵步驟。這次使用的數(shù)據(jù) 庫 是：P101SC18122835-01-Zea_mays-ensemblrelea.fasta:131585 個序列。質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)格式為*raw，存儲了質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)的完整掃描信息。原始文件將直接導(dǎo)入Proteome Discoverer2.2 軟件，用于數(shù)據(jù)庫檢索、肽和蛋白質(zhì)定量。

1.6 蛋白質(zhì)功能注釋

GO 注釋是利用interproscan 軟件對鑒定到的蛋白質(zhì)進行注釋分析，涉及6 個數(shù)據(jù)庫的搜索。KEGG與COG 注釋首先將鑒定到的蛋白質(zhì)進行BLAST 比對（blastp，E-value ≤1e-4），然后對于每一條序列的BLAST 結(jié)果選取score 得分最高的進行注釋。

1.7 差異蛋白篩選

確定需要比較的樣品對：2 個品種、2 個處理確定4 個比較分組，分別為ZXD_ZXC、ZND_ZNC、ZND_ZXD、ZNC_ZXC。取比較樣品對中各蛋白質(zhì)生物重復(fù)性所有定量值的平均值之比作為差異倍數(shù)FC。采用t檢驗對各蛋白的相對定量值進行檢驗，以p值作為判斷差異是否顯著的指標。當FC ≥1.2 且P-vaule ≤0.05 表示蛋白質(zhì)表達量上調(diào)，F(xiàn)C ≤0.83 且P-vaule ≤0.05 表示蛋白質(zhì)表達量下調(diào)［8］。

1.8 差異表達蛋白富集分析

GO 功能顯著性富集分析首先把所有差異蛋白質(zhì)向Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org/）的各個term 映射，計算每個term 的蛋白質(zhì)數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗，找出與所有蛋白質(zhì)背景相比，在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO term。計算得到P-value 值，以P-value ≤0.05 為閾值，滿足此條件的GO term 定義為在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO term。KEGG Pathway 顯著性富集分析方法同 GO 功能富集分析，是以 KEGG Pathway 為單位，應(yīng)用超幾何檢驗，以P-value ≤0.05 為閾值，找出與所有鑒定到蛋白背景相比，在差異蛋白中顯著性富集的 Pathway。

2 結(jié)果與分析

2.1 iTRAQ 數(shù)據(jù)鑒定及質(zhì)控分析結(jié)果

利用Proteome Discoverer2.2 軟件對檢索結(jié)果進一步過濾：可信度在95%以上的肽匹配圖譜（Peptide Spectrum Matches，簡稱PSMs）為可信PSMs，至少包含一個unique 肽段（特有肽段，簡稱肽段）的蛋白為可信蛋白，只保留可信的肽匹配圖譜和蛋白，并做FDR 驗證，剔除FDR 大于5%的肽段和蛋白。下表是鑒定到的肽段數(shù)和蛋白數(shù)總體情況。只利用表中展示的過濾后的結(jié)果來做后續(xù)分析。

表1 蛋白質(zhì)鑒定信息Table 1 Information of protein identification

質(zhì)譜下機的數(shù)據(jù)，在搜庫完成后，需要進行一系列質(zhì)控，包括肽段長度分布（圖1A）、蛋白分子量分布（圖1B）、蛋白覆蓋度分布（圖1C）、肽段數(shù)分布（圖1D）。每種質(zhì)譜儀都有自身的測量范圍，本次鑒定到肽段的長度分布如圖1A 所示，肽段長度90%以上在6 ～22，峰值在10 ～12，肽段長度及分布合理。

2.2 蛋白功能注釋

本研究將鑒定到的蛋白質(zhì)分別注釋到GO、KEGG、COG 和IPR 數(shù)據(jù)庫，以了解不同蛋白質(zhì)的功能特性，數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果統(tǒng)計見圖2。這4個數(shù)據(jù)庫共同注釋到的蛋白質(zhì)有3 468 個，GO 數(shù)據(jù)庫沒有單獨注釋到蛋白，COG 數(shù)據(jù)庫單獨注釋到1 個蛋白，KEGG 數(shù)據(jù)庫單獨注釋到490 個蛋白，IPR 數(shù)據(jù)庫單獨注釋到6 個蛋白。

圖1 蛋白數(shù)據(jù)質(zhì)控Fig. 1 Protein data quality control

圖2 功能注釋結(jié)果Fig. 2 Function annotation result

2.3 玉米V12 時期響應(yīng)干旱脅迫差異表達蛋白

通過iTRAQ 技術(shù)標記差異比較組樣本蛋白，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定和定量獲得不同表達量蛋白，分析后得到差異蛋白。本研究以2 種具有不同耐旱性的玉米雜交種為材料，在干旱脅迫和正常澆水條件下，‘農(nóng)單476’差異表達蛋白49 個，包括上調(diào)29 個，下調(diào)20 個（表2、表3)，‘眾信978’差異表達蛋白64 個，包括上調(diào)46 個，下調(diào)18 個(表2、 表4），表明干旱脅迫下耐旱性不同的玉米雜交種葉片蛋白表達量均發(fā)生不同程度變化以抵御干旱保持植株正常生長，耐旱型‘農(nóng)單476’差異表達蛋白數(shù)目低于敏感型‘眾信978’差異表達蛋白數(shù)目，表明耐旱型玉米品種在干旱脅迫下只需要較少蛋白互作變化就能抵御干旱，正常生長，適應(yīng)性更強。

表2 蛋白差異結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Statistical results for DAPs

表3 ‘農(nóng)單476’在干旱脅迫下的差異表達蛋白Table 3 The DAPs of‘ND476’under drought stress

表4 ‘眾信978’在干旱脅迫下的差異表達蛋白Table 4 The DAPs of‘ZX978’under drought stress

續(xù)表：

從圖3A 中可以看出干旱脅迫下的‘農(nóng)單476’的差異表達蛋白，上半部分（29 個DAPs）表達水平：ZND ＞ZNC，對于這部分差異蛋白來說，表達量逐漸升高，因此這部分差異蛋白表現(xiàn)為上調(diào)；下半部分（20 個DAPs）差異蛋白表現(xiàn)則相反。從圖3B 中可以看出干旱脅迫下‘眾信978’的差異表達蛋白，上半部分（18 個DAPs）表達水平：ZXD＜ZXC，對于這部分差異蛋白來說，表達量逐漸降低，因此這部分差異蛋白表現(xiàn)為下調(diào)；下半部分（46個DAPs）差異蛋白表現(xiàn)則相反。

圖3 干旱前后的DAPs 在所有個體中的聚類圖Fig. 3 Cluster of DAPs before and after drought stress in all individuals

2.4 ZND_ZNC 比較組中差異蛋白功能富集分析

ZND_ZNC 比較組中得到差異蛋白49 個，ZND組與ZNC 組分別代表的是‘農(nóng)單476’雜交種干旱處理后和水對照，通過這2 個組的比較，得到玉米耐旱品種中響應(yīng)干旱的關(guān)鍵差異蛋白。對該比較組差異蛋白分別進行GO 富集和KEGG pathway 富集分析。GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集到4 個分子功能的GO terms 見圖4，分別為：過渡金屬離子結(jié)合、半胱氨酸類肽酶活性、鐵離子結(jié)合和電子載體活性。對差異表達蛋白的KEGG pathway 富集分析見圖5，這些差異蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和苯并惡唑嗪酮類化合物（BXs）的生物合成信號通路中最顯著富集。

圖4 ZND_ZNC 比較組差異蛋白的GO 富集分析Fig. 4 GO enrichment analysis of ZND_ZNC comparison DAPs

圖5 ZND_ZNC 比較組差異蛋白的KEGG 途徑富集分析Fig. 5 KEGG pathway enrichment analysis of ZND_ZNC comparison DAPs

2.5 ZXD_ZXC 比較組差異蛋白功能富集分析

ZXD_ZXC 比較組中有差異蛋白64 個，ZXD 組與ZXC 組分別代表的是‘眾信978’雜交種干旱處理后和水對照，通過這2 個組的比較，得到玉米敏感型品種中響應(yīng)干旱的關(guān)鍵差異蛋白。對該比較組差異蛋白分別進行GO 富集和KEGG pathway 富集分析(圖6、圖7)。發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集到的GO terms，其中4 個顯著富集的生物過程分別為細胞大分子代謝過程、細胞蛋白質(zhì)代謝過程、基因表達過程、翻譯過程；5 個顯著富集的細胞組分類別分別為細胞部分、細胞、大分子復(fù)合物、細胞器、核糖體；2 個顯著富集的分子功能分別為核糖體結(jié)構(gòu)組成和RNA結(jié)合。ZXD_ZXC 比較組差異蛋白的KEGG pathway分析表明，差異蛋白在核糖體通路中顯著富集。

圖6 ZXD_ZXC 比較組差異蛋白的GO 富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of ZXD_ZXC comparison DAPs

圖7 ZXD_ZXC 比較組差異蛋白的KEGG 途徑富集分析Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis of ZXD_ZXC comparison DAPs

3 討論

面對全球氣候變化，全球農(nóng)業(yè)的主要目標是發(fā)展耐旱作物［9-10］。為此，充分了解與植物耐旱性有關(guān)的生理、生化和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)變得十分必要。在此，基于iTRAQ 技術(shù)對2 種耐旱性不同玉米雜交品種(耐旱型品種‘農(nóng)單476’和敏感型品種‘眾信978’)進行蛋白質(zhì)組比較分析，分別對2 個品種在干旱脅迫條件下的差異表達蛋白進行了GO 和 KEGG 富集分析，報道了玉米耐旱的關(guān)鍵差異表達蛋白和調(diào)控途徑。研究結(jié)果進一步加深了對玉米抗旱性調(diào)控機制的認識，為今后的定向克隆研究及耐旱關(guān)鍵基因的功能驗證奠定了基礎(chǔ)。

3.1 ‘農(nóng)單476’在干旱條件下的KEGG 通路響應(yīng)

本研究中參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工途徑的3個 差 異 表 達 蛋 白HSP70（Zm00001d012420_P001）、sHSF（Zm00001d031325_P001） 和UBX（Zm00001d005727_P001）均為上調(diào)表達（表3）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)加工折疊的關(guān)鍵場所?；鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)主要與脂質(zhì)的合成與運代謝及儲存和調(diào)節(jié) Ca2+代謝及儲存和調(diào)節(jié) Ca2+濃度相關(guān)；糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則與外輸性蛋白質(zhì)的合成、加工修飾及轉(zhuǎn)運過程密切 相關(guān)［11］。劉纓等［12］從人骨骼肌cDNA 文庫中，分離，鑒定視網(wǎng)膜感光受體外周蛋白的結(jié)合蛋白(PBP)-DNAJ(HSP40)類分子伴侶，并指出DNAJ 可與HSP70(DNAK)協(xié)同發(fā)揮重要功能外。分子伴侶能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的折疊，BiP 蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)最豐富的分子伴侶［13］，BiP 蛋白屬于HSP70 蛋白家族，能與ATP 結(jié)合，并與含有J 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（J 蛋白）互作［14］。J 蛋白與BiP 蛋白互作后能刺激細胞內(nèi)ATP 水解，促進BiP 蛋白捕獲進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的多肽，伴隨著核苷酸翻譯的改變，新合成的多肽片段被緩慢釋放到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中［15］。前人研究已經(jīng)證實了次級代謝途徑對于玉米耐旱的機制與作用［16］。通過對差異蛋白的KEGG pathway 富集分析，差異蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和苯并惡唑嗪酮類化合物（BXs）的生物合成信號通路中最顯著富集。王萱等［7］對玉米耐旱自交系YE8112 特有差異蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)其主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工和色氨酸代謝通路，與本研究結(jié)果一致。楊杰［17］的研究發(fā)現(xiàn)強耐旱系PHBA6 響應(yīng)干旱的差異蛋白中參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工的蛋白占總差異蛋白的8%。管培燕［11］的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白SES1 具有分子伴侶活性，能參與蛋白質(zhì)的折疊過程，具有調(diào)控擬南芥鹽脅迫抗性的重要作用。上述分析結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工途徑是‘農(nóng)單476’響應(yīng)干旱脅迫的重要通路。

3.2 ‘眾信978’在干旱脅迫下的KEGG 通路響應(yīng)

核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所，是受非生物脅迫影響的基本生物學(xué)過程之一［18］。干旱脅迫條件下蛋白的表達情況與植物抗旱性有密切聯(lián)系［19］。核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分，在細胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成中發(fā)揮重要作用，此外，還具有獨立于蛋白質(zhì)生物合成作用。核糖體具有參與DNA 修復(fù)、細胞發(fā)育調(diào)控和細胞分化等核糖體外功能［20-22］。核糖體蛋白L28 在馬鈴薯與青枯病菌互作過程中發(fā)揮作用［23］；核糖體蛋白L14 受逆境調(diào)控，參與橡膠樹對干旱脅迫的響應(yīng)［24］。在本研究中‘眾信978’在干旱條件下表達的差異蛋白顯著富集在核糖體途徑中，并且富集到核糖體途徑的7 個蛋白（L23Ae、L27Ae、L35、L20、S18、L13e、L36e）均為下調(diào)表達（表4），造成該現(xiàn)象的原因為干旱脅迫對‘眾信978’的影響。干旱脅迫條件導(dǎo)致‘眾信978’的核糖體一些相關(guān)蛋白的表達下降，進而可能影響耐旱相關(guān)蛋白的合成。上述分析結(jié)果表明干旱脅迫可能通過影響核糖體蛋白的表達變化進而影響玉米雜交種‘眾信978’的生長發(fā)育。

3.3 ‘農(nóng)單476’轉(zhuǎn)錄與蛋白水平的干旱響應(yīng)

之前的研究結(jié)果表明，干旱脅迫前后，雜交種‘農(nóng)單476’在轉(zhuǎn)錄水平上篩選出70 個差異表達的基因［26］，然而在蛋白水平上只有49 個顯著差異的蛋白，其原因可能是部分差異基因并沒有發(fā)揮實際的功能作用，也可能是檢測和篩選手段造成的。但是有一點是確定的，即耐旱品種‘農(nóng)單476’的差異基因和差異蛋白均少于敏感型品種‘眾信978’。在轉(zhuǎn)錄結(jié)果中一個次級代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的DEG 苯并惡嗪類1(Zm00001d048709) 差異表 達［25］，與蛋白組研究結(jié)果一致，又互相佐證，表明次級代謝通路是‘農(nóng)單476’響應(yīng)干旱脅迫的一個 重要通路。

4 結(jié)論

對2 個抗旱性不同的玉米雜交種在V12 時期12 d 田間自然干旱處理后的玉米葉片進行了全面的iTRAQ 蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析。正常供水和干旱脅迫條件下總共有873 個DAPs 從4 個實驗比較中被識別出來?！r(nóng)單476’的DAPs 主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和次級代謝化合物的生物合成通路，而‘眾信978’的DAPs 富集在核糖體的相關(guān)通路。本研究結(jié)果表明，‘農(nóng)單476’玉米葉片具有較強的抵御干旱脅迫的能力，這是由于它們具有較高的sHSP 表達水平和較高的HSPs 表達水平；‘眾信978’玉米葉片的抗旱相關(guān)蛋白均為下調(diào)表達?！r(nóng)單476’在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上均表現(xiàn)出更強的耐旱性。本研究加深了對V12 時期玉米葉片響應(yīng)干旱的關(guān)鍵基因、蛋白和代謝途徑的理解，為后續(xù)功能驗證奠定了基礎(chǔ)。