劉 過(guò)，劉松濤，董安憶，楊亞桐，段會(huì)軍

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/華北作物種質(zhì)資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

玉米是重要的糧食作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)占據(jù)重要地位。干旱是制約玉米高品質(zhì)豐產(chǎn)的主要原因，在不同程度上限制了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植物的分子、細(xì)胞、器官和個(gè)體水平發(fā)生不利變化，如水平衡在植物中受到破壞，導(dǎo)致老葉枯黃，新葉萎蔫生長(zhǎng)緩慢，活性氧清除系統(tǒng)紊亂，激素分泌紊亂 等［1］。同時(shí)，植物對(duì)干旱協(xié)迫做出有利的應(yīng)激反應(yīng)，首先通過(guò)傳遞干旱脅迫信號(hào)來(lái)調(diào)控抗旱基因的表達(dá)，然后合成一系列調(diào)控植物生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)。這些脅迫調(diào)節(jié)反應(yīng)反映在形態(tài)變化、氣孔調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)、活性氧清除等方面，但干旱脅迫的響應(yīng)機(jī)制往往需要多種機(jī)制的協(xié)同作用［2］。玉米在喇叭口期生長(zhǎng)發(fā)育最旺盛，對(duì)肥水條件最敏感，這一階段水分的缺乏會(huì)導(dǎo)致雄穗發(fā)育不良，雌穗分化受阻，導(dǎo)致每穗粒數(shù)嚴(yán)重減少，最終影響后期產(chǎn)量［3］。因此，研究V12（玉米12 葉齡）時(shí)期玉米響應(yīng)干旱脅迫差異表達(dá)蛋白，對(duì)揭示玉米V12 時(shí)期抵御干旱的調(diào)控機(jī)理有重要意義。

2001 年，真正意義上有關(guān)玉米的蛋白質(zhì)組學(xué)研究正式開(kāi)始［4］，包括玉米不同器官/組織的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，玉米不同器官間相互關(guān)系的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，玉米細(xì)胞器蛋白質(zhì)組學(xué)分析，玉米脅迫相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)分析。近20 年來(lái)，國(guó)內(nèi)外玉米蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了大量研究，主要集中在玉米不同組織及生物或非生物脅迫。本研究采用iTRAQ 技術(shù)，以耐旱性不同的玉米雜交種為材料，比較干旱脅迫下V12 時(shí)期玉米葉片蛋白質(zhì)水平上的差異，分析與響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)的差異蛋白的特性及生物學(xué)功能，初步揭示玉米在V12 時(shí)期抵御干旱脅迫的分子機(jī)理，為玉米抗旱育種及品種改良進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與干旱處理

試驗(yàn)在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)清苑實(shí)驗(yàn)基地抗旱棚內(nèi)進(jìn)行，以玉米雜交種‘農(nóng)單476’和‘眾信978’為試驗(yàn)材料，于2018 年6 月15 日播種于河北保定清苑抗旱棚。雜交種‘農(nóng)單476’是由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米改良中心育成的國(guó)審品種，‘眾信978’是由河北眾信種子科技有限公司選育省審品種。由河北農(nóng)林科學(xué)院旱作所鑒定‘農(nóng)單476’為抗旱品種，‘眾信978’為敏感品種。小區(qū)面積25 m2，行間距0.6 m， 株距0.3 m，雙粒穴播，水旱區(qū)1 m 防水墻間隔。各小區(qū)底肥均為復(fù)合肥512 kg/hm2。當(dāng)75%的玉米植株長(zhǎng)到8 葉時(shí)（7 月18 日）開(kāi)始干旱處理，采用TZS-1 土壤水分測(cè)定儀（浙江拓普科技有限公司）對(duì)地下1 m 土壤相對(duì)含水量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，每20 cm 測(cè)量1 次。對(duì)照組控制田間土壤含水量20%～30%，處理組控制田間土壤含水量5%～10%。到12 葉時(shí)（7月30 日）取長(zhǎng)勢(shì)相近的玉米的旗葉葉尖部分五厘米左右液氮速凍，3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，然后儲(chǔ)存在-80 ℃ 超低溫冰箱用于進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2 總蛋白提取

利用冷丙酮法［5-6］從兩個(gè)玉米雜交種的試驗(yàn)組和對(duì)照組的葉片組織中提取總蛋白，每個(gè)樣品設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 蛋白酶解與iTRAQ 標(biāo)記

分別取蛋白樣品100 μg，加入蛋白溶液至100 μL， 加入2 μL 1μg/μL 胰酶和500 μL 100 mmol/L TEAB 緩沖液，混勻，37 ℃下酶切過(guò)夜。加入相同體積的1%甲酸，混勻，室溫12 000 r/min 離心5 min。取上清，緩慢通過(guò)C18 脫鹽塔，用1 mL 清洗液（0.1%甲酸，4%乙腈）連續(xù)3 次。加入0.4 mL 洗脫液（0.1%甲酸，45%乙腈）連續(xù)2 次。洗脫液樣品混合后，冷凍干燥。加入20 μL 0.5 mmol/L TEAB 緩沖液再次溶解，加入足夠的iTRAQ 標(biāo)記試劑溶于異丙醇中，室溫下倒置攪拌1 h。加入100 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH=8)停止反應(yīng)，等體積標(biāo)記后取樣并混合、脫鹽和冷凍干燥。多個(gè)標(biāo)記組時(shí)取所有樣品進(jìn)行等質(zhì)量蛋白混合作為標(biāo)記組間的共同參照樣品。

1.4 SCX 分級(jí)與LC-MS/MS

采用L-3000 高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行強(qiáng)陽(yáng)離子交換（SCX）色譜分離iTRAQ 標(biāo)記的肽混合物。詳細(xì)步驟參考本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表論文［7］。采用Q 型精密TM HF-X 質(zhì)譜儀，易構(gòu)建TM 離子源，設(shè)置離子噴射電壓為2.3 kV，離子傳輸管溫度320 ℃，質(zhì)譜儀采用數(shù)據(jù)相關(guān)采集方式，質(zhì)譜掃描范圍為m/Z 350 ～1 500，一級(jí)質(zhì)譜儀分辨率為60 000(200 m/z)， C-trap 的最大容量為3×106，C-trap 的最大注入時(shí)間為20 ms，用高能碰撞劈裂HCD 法選擇離子強(qiáng)度在全掃描范圍內(nèi)前40 位的母離子進(jìn)行裂解，并用二次質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)。二次質(zhì)譜的分辨率設(shè)定為15 000 (200 m/z)，C-trap 的最大容量為1×105，C-trap 的最大注入時(shí)間為45 ms，肽片段的碰撞能量設(shè)定為32%，閾值強(qiáng)度設(shè)定為8.3×103，排除的動(dòng)態(tài)范圍設(shè)定為60 s，產(chǎn)生質(zhì)譜檢測(cè)原始數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索質(zhì)譜數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)庫(kù)的選擇是生物信息后續(xù)分析的關(guān)鍵步驟。這次使用的數(shù)據(jù) 庫(kù) 是：P101SC18122835-01-Zea_mays-ensemblrelea.fasta:131585 個(gè)序列。質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)格式為*raw，存儲(chǔ)了質(zhì)譜儀數(shù)據(jù)的完整掃描信息。原始文件將直接導(dǎo)入Proteome Discoverer2.2 軟件，用于數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、肽和蛋白質(zhì)定量。

1.6 蛋白質(zhì)功能注釋

GO 注釋是利用interproscan 軟件對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋分析，涉及6 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索。KEGG與COG 注釋首先將鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行BLAST 比對(duì)（blastp，E-value ≤1e-4），然后對(duì)于每一條序列的BLAST 結(jié)果選取score 得分最高的進(jìn)行注釋。

1.7 差異蛋白篩選

確定需要比較的樣品對(duì)：2 個(gè)品種、2 個(gè)處理確定4 個(gè)比較分組，分別為ZXD_ZXC、ZND_ZNC、ZND_ZXD、ZNC_ZXC。取比較樣品對(duì)中各蛋白質(zhì)生物重復(fù)性所有定量值的平均值之比作為差異倍數(shù)FC。采用t檢驗(yàn)對(duì)各蛋白的相對(duì)定量值進(jìn)行檢驗(yàn)，以p值作為判斷差異是否顯著的指標(biāo)。當(dāng)FC ≥1.2 且P-vaule ≤0.05 表示蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)，F(xiàn)C ≤0.83 且P-vaule ≤0.05 表示蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)［8］。

1.8 差異表達(dá)蛋白富集分析

GO 功能顯著性富集分析首先把所有差異蛋白質(zhì)向Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org/）的各個(gè)term 映射，計(jì)算每個(gè)term 的蛋白質(zhì)數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與所有蛋白質(zhì)背景相比，在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO term。計(jì)算得到P-value 值，以P-value ≤0.05 為閾值，滿足此條件的GO term 定義為在差異蛋白質(zhì)中顯著富集的GO term。KEGG Pathway 顯著性富集分析方法同 GO 功能富集分析，是以 KEGG Pathway 為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，以P-value ≤0.05 為閾值，找出與所有鑒定到蛋白背景相比，在差異蛋白中顯著性富集的 Pathway。

2 結(jié)果與分析

2.1 iTRAQ 數(shù)據(jù)鑒定及質(zhì)控分析結(jié)果

利用Proteome Discoverer2.2 軟件對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)一步過(guò)濾：可信度在95%以上的肽匹配圖譜（Peptide Spectrum Matches，簡(jiǎn)稱PSMs）為可信PSMs，至少包含一個(gè)unique 肽段（特有肽段，簡(jiǎn)稱肽段）的蛋白為可信蛋白，只保留可信的肽匹配圖譜和蛋白，并做FDR 驗(yàn)證，剔除FDR 大于5%的肽段和蛋白。下表是鑒定到的肽段數(shù)和蛋白數(shù)總體情況。只利用表中展示的過(guò)濾后的結(jié)果來(lái)做后續(xù)分析。

表1 蛋白質(zhì)鑒定信息Table 1 Information of protein identification

質(zhì)譜下機(jī)的數(shù)據(jù)，在搜庫(kù)完成后，需要進(jìn)行一系列質(zhì)控，包括肽段長(zhǎng)度分布（圖1A）、蛋白分子量分布（圖1B）、蛋白覆蓋度分布（圖1C）、肽段數(shù)分布（圖1D）。每種質(zhì)譜儀都有自身的測(cè)量范圍，本次鑒定到肽段的長(zhǎng)度分布如圖1A 所示，肽段長(zhǎng)度90%以上在6 ～22，峰值在10 ～12，肽段長(zhǎng)度及分布合理。

2.2 蛋白功能注釋

本研究將鑒定到的蛋白質(zhì)分別注釋到GO、KEGG、COG 和IPR 數(shù)據(jù)庫(kù)，以了解不同蛋白質(zhì)的功能特性，數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖2。這4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)共同注釋到的蛋白質(zhì)有3 468 個(gè)，GO 數(shù)據(jù)庫(kù)沒(méi)有單獨(dú)注釋到蛋白，COG 數(shù)據(jù)庫(kù)單獨(dú)注釋到1 個(gè)蛋白，KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)單獨(dú)注釋到490 個(gè)蛋白，IPR 數(shù)據(jù)庫(kù)單獨(dú)注釋到6 個(gè)蛋白。

圖1 蛋白數(shù)據(jù)質(zhì)控Fig. 1 Protein data quality control

圖2 功能注釋結(jié)果Fig. 2 Function annotation result

2.3 玉米V12 時(shí)期響應(yīng)干旱脅迫差異表達(dá)蛋白

通過(guò)iTRAQ 技術(shù)標(biāo)記差異比較組樣本蛋白，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定和定量獲得不同表達(dá)量蛋白，分析后得到差異蛋白。本研究以2 種具有不同耐旱性的玉米雜交種為材料，在干旱脅迫和正常澆水條件下，‘農(nóng)單476’差異表達(dá)蛋白49 個(gè)，包括上調(diào)29 個(gè)，下調(diào)20 個(gè)（表2、表3)，‘眾信978’差異表達(dá)蛋白64 個(gè)，包括上調(diào)46 個(gè)，下調(diào)18 個(gè)(表2、 表4），表明干旱脅迫下耐旱性不同的玉米雜交種葉片蛋白表達(dá)量均發(fā)生不同程度變化以抵御干旱保持植株正常生長(zhǎng)，耐旱型‘農(nóng)單476’差異表達(dá)蛋白數(shù)目低于敏感型‘眾信978’差異表達(dá)蛋白數(shù)目，表明耐旱型玉米品種在干旱脅迫下只需要較少蛋白互作變化就能抵御干旱，正常生長(zhǎng)，適應(yīng)性更強(qiáng)。

表2 蛋白差異結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistical results for DAPs

表3 ‘農(nóng)單476’在干旱脅迫下的差異表達(dá)蛋白Table 3 The DAPs of‘ND476’under drought stress

表4 ‘眾信978’在干旱脅迫下的差異表達(dá)蛋白Table 4 The DAPs of‘ZX978’under drought stress

續(xù)表：

從圖3A 中可以看出干旱脅迫下的‘農(nóng)單476’的差異表達(dá)蛋白，上半部分（29 個(gè)DAPs）表達(dá)水平：ZND ＞ZNC，對(duì)于這部分差異蛋白來(lái)說(shuō)，表達(dá)量逐漸升高，因此這部分差異蛋白表現(xiàn)為上調(diào)；下半部分（20 個(gè)DAPs）差異蛋白表現(xiàn)則相反。從圖3B 中可以看出干旱脅迫下‘眾信978’的差異表達(dá)蛋白，上半部分（18 個(gè)DAPs）表達(dá)水平：ZXD＜ZXC，對(duì)于這部分差異蛋白來(lái)說(shuō)，表達(dá)量逐漸降低，因此這部分差異蛋白表現(xiàn)為下調(diào)；下半部分（46個(gè)DAPs）差異蛋白表現(xiàn)則相反。

圖3 干旱前后的DAPs 在所有個(gè)體中的聚類圖Fig. 3 Cluster of DAPs before and after drought stress in all individuals

2.4 ZND_ZNC 比較組中差異蛋白功能富集分析

ZND_ZNC 比較組中得到差異蛋白49 個(gè)，ZND組與ZNC 組分別代表的是‘農(nóng)單476’雜交種干旱處理后和水對(duì)照，通過(guò)這2 個(gè)組的比較，得到玉米耐旱品種中響應(yīng)干旱的關(guān)鍵差異蛋白。對(duì)該比較組差異蛋白分別進(jìn)行GO 富集和KEGG pathway 富集分析。GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集到4 個(gè)分子功能的GO terms 見(jiàn)圖4，分別為：過(guò)渡金屬離子結(jié)合、半胱氨酸類肽酶活性、鐵離子結(jié)合和電子載體活性。對(duì)差異表達(dá)蛋白的KEGG pathway 富集分析見(jiàn)圖5，這些差異蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和苯并惡唑嗪酮類化合物（BXs）的生物合成信號(hào)通路中最顯著富集。

圖4 ZND_ZNC 比較組差異蛋白的GO 富集分析Fig. 4 GO enrichment analysis of ZND_ZNC comparison DAPs

圖5 ZND_ZNC 比較組差異蛋白的KEGG 途徑富集分析Fig. 5 KEGG pathway enrichment analysis of ZND_ZNC comparison DAPs

2.5 ZXD_ZXC 比較組差異蛋白功能富集分析

ZXD_ZXC 比較組中有差異蛋白64 個(gè)，ZXD 組與ZXC 組分別代表的是‘眾信978’雜交種干旱處理后和水對(duì)照，通過(guò)這2 個(gè)組的比較，得到玉米敏感型品種中響應(yīng)干旱的關(guān)鍵差異蛋白。對(duì)該比較組差異蛋白分別進(jìn)行GO 富集和KEGG pathway 富集分析(圖6、圖7)。發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集到的GO terms，其中4 個(gè)顯著富集的生物過(guò)程分別為細(xì)胞大分子代謝過(guò)程、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、基因表達(dá)過(guò)程、翻譯過(guò)程；5 個(gè)顯著富集的細(xì)胞組分類別分別為細(xì)胞部分、細(xì)胞、大分子復(fù)合物、細(xì)胞器、核糖體；2 個(gè)顯著富集的分子功能分別為核糖體結(jié)構(gòu)組成和RNA結(jié)合。ZXD_ZXC 比較組差異蛋白的KEGG pathway分析表明，差異蛋白在核糖體通路中顯著富集。

圖6 ZXD_ZXC 比較組差異蛋白的GO 富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of ZXD_ZXC comparison DAPs

圖7 ZXD_ZXC 比較組差異蛋白的KEGG 途徑富集分析Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis of ZXD_ZXC comparison DAPs

3 討論

面對(duì)全球氣候變化，全球農(nóng)業(yè)的主要目標(biāo)是發(fā)展耐旱作物［9-10］。為此，充分了解與植物耐旱性有關(guān)的生理、生化和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)變得十分必要。在此，基于iTRAQ 技術(shù)對(duì)2 種耐旱性不同玉米雜交品種(耐旱型品種‘農(nóng)單476’和敏感型品種‘眾信978’)進(jìn)行蛋白質(zhì)組比較分析，分別對(duì)2 個(gè)品種在干旱脅迫條件下的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了GO 和 KEGG 富集分析，報(bào)道了玉米耐旱的關(guān)鍵差異表達(dá)蛋白和調(diào)控途徑。研究結(jié)果進(jìn)一步加深了對(duì)玉米抗旱性調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為今后的定向克隆研究及耐旱關(guān)鍵基因的功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

3.1 ‘農(nóng)單476’在干旱條件下的KEGG 通路響應(yīng)

本研究中參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工途徑的3個(gè) 差 異 表 達(dá) 蛋 白HSP70（Zm00001d012420_P001）、sHSF（Zm00001d031325_P001） 和UBX（Zm00001d005727_P001）均為上調(diào)表達(dá)（表3）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)加工折疊的關(guān)鍵場(chǎng)所?；鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)主要與脂質(zhì)的合成與運(yùn)代謝及儲(chǔ)存和調(diào)節(jié) Ca2+代謝及儲(chǔ)存和調(diào)節(jié) Ca2+濃度相關(guān)；糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則與外輸性蛋白質(zhì)的合成、加工修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程密切 相關(guān)［11］。劉纓等［12］從人骨骼肌cDNA 文庫(kù)中，分離，鑒定視網(wǎng)膜感光受體外周蛋白的結(jié)合蛋白(PBP)-DNAJ(HSP40)類分子伴侶，并指出DNAJ 可與HSP70(DNAK)協(xié)同發(fā)揮重要功能外。分子伴侶能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的折疊，BiP 蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)最豐富的分子伴侶［13］，BiP 蛋白屬于HSP70 蛋白家族，能與ATP 結(jié)合，并與含有J 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)（J 蛋白）互作［14］。J 蛋白與BiP 蛋白互作后能刺激細(xì)胞內(nèi)ATP 水解，促進(jìn)BiP 蛋白捕獲進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的多肽，伴隨著核苷酸翻譯的改變，新合成的多肽片段被緩慢釋放到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中［15］。前人研究已經(jīng)證實(shí)了次級(jí)代謝途徑對(duì)于玉米耐旱的機(jī)制與作用［16］。通過(guò)對(duì)差異蛋白的KEGG pathway 富集分析，差異蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和苯并惡唑嗪酮類化合物（BXs）的生物合成信號(hào)通路中最顯著富集。王萱等［7］對(duì)玉米耐旱自交系YE8112 特有差異蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工和色氨酸代謝通路，與本研究結(jié)果一致。楊杰［17］的研究發(fā)現(xiàn)強(qiáng)耐旱系PHBA6 響應(yīng)干旱的差異蛋白中參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工的蛋白占總差異蛋白的8%。管培燕［11］的研究發(fā)現(xiàn)擬南芥內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白SES1 具有分子伴侶活性，能參與蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程，具有調(diào)控?cái)M南芥鹽脅迫抗性的重要作用。上述分析結(jié)果表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工途徑是‘農(nóng)單476’響應(yīng)干旱脅迫的重要通路。

3.2 ‘眾信978’在干旱脅迫下的KEGG 通路響應(yīng)

核糖體是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，是受非生物脅迫影響的基本生物學(xué)過(guò)程之一［18］。干旱脅迫條件下蛋白的表達(dá)情況與植物抗旱性有密切聯(lián)系［19］。核糖體蛋白是組成核糖體的主要成分，在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成中發(fā)揮重要作用，此外，還具有獨(dú)立于蛋白質(zhì)生物合成作用。核糖體具有參與DNA 修復(fù)、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控和細(xì)胞分化等核糖體外功能［20-22］。核糖體蛋白L28 在馬鈴薯與青枯病菌互作過(guò)程中發(fā)揮作用［23］；核糖體蛋白L14 受逆境調(diào)控，參與橡膠樹(shù)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)［24］。在本研究中‘眾信978’在干旱條件下表達(dá)的差異蛋白顯著富集在核糖體途徑中，并且富集到核糖體途徑的7 個(gè)蛋白（L23Ae、L27Ae、L35、L20、S18、L13e、L36e）均為下調(diào)表達(dá)（表4），造成該現(xiàn)象的原因?yàn)楦珊得{迫對(duì)‘眾信978’的影響。干旱脅迫條件導(dǎo)致‘眾信978’的核糖體一些相關(guān)蛋白的表達(dá)下降，進(jìn)而可能影響耐旱相關(guān)蛋白的合成。上述分析結(jié)果表明干旱脅迫可能通過(guò)影響核糖體蛋白的表達(dá)變化進(jìn)而影響玉米雜交種‘眾信978’的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.3 ‘農(nóng)單476’轉(zhuǎn)錄與蛋白水平的干旱響應(yīng)

之前的研究結(jié)果表明，干旱脅迫前后，雜交種‘農(nóng)單476’在轉(zhuǎn)錄水平上篩選出70 個(gè)差異表達(dá)的基因［26］，然而在蛋白水平上只有49 個(gè)顯著差異的蛋白，其原因可能是部分差異基因并沒(méi)有發(fā)揮實(shí)際的功能作用，也可能是檢測(cè)和篩選手段造成的。但是有一點(diǎn)是確定的，即耐旱品種‘農(nóng)單476’的差異基因和差異蛋白均少于敏感型品種‘眾信978’。在轉(zhuǎn)錄結(jié)果中一個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成相關(guān)的DEG 苯并惡嗪類1(Zm00001d048709) 差異表 達(dá)［25］，與蛋白組研究結(jié)果一致，又互相佐證，表明次級(jí)代謝通路是‘農(nóng)單476’響應(yīng)干旱脅迫的一個(gè) 重要通路。

4 結(jié)論

對(duì)2 個(gè)抗旱性不同的玉米雜交種在V12 時(shí)期12 d 田間自然干旱處理后的玉米葉片進(jìn)行了全面的iTRAQ 蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析。正常供水和干旱脅迫條件下總共有873 個(gè)DAPs 從4 個(gè)實(shí)驗(yàn)比較中被識(shí)別出來(lái)。‘農(nóng)單476’的DAPs 主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和次級(jí)代謝化合物的生物合成通路，而‘眾信978’的DAPs 富集在核糖體的相關(guān)通路。本研究結(jié)果表明，‘農(nóng)單476’玉米葉片具有較強(qiáng)的抵御干旱脅迫的能力，這是由于它們具有較高的sHSP 表達(dá)水平和較高的HSPs 表達(dá)水平；‘眾信978’玉米葉片的抗旱相關(guān)蛋白均為下調(diào)表達(dá)?！r(nóng)單476’在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上均表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐旱性。本研究加深了對(duì)V12 時(shí)期玉米葉片響應(yīng)干旱的關(guān)鍵基因、蛋白和代謝途徑的理解，為后續(xù)功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。