曹智翔，李升云，于晨晨，田益玲,2,3

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2. 河北?。ㄐ吓_）核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 邢臺 054000；3. 河北省核桃工程技術(shù)中心，河北 邢臺 054000 ）

核桃（Juglans regiaL.）為胡桃科胡桃屬植物，在全球廣泛種植。有研究報(bào)道稱核桃雄花產(chǎn)量與核桃相當(dāng)，核桃雄花提取物在中國民間被用于治療各種疾病，如癌癥、皮炎、濕疹、慢性支氣管炎等疾?。?］；核桃雄花醇提物能夠降血糖，提高糖尿病大鼠胰高血糖素水平［2］；核桃雄花中多酚、黃酮含量豐富，含有多個天然活性基團(tuán)，具有預(yù)防心腦血管疾病、抗衰老、抗氧化、降血脂等功能［3-4］，核桃雄花中存在大量的生物活性化合物，其提取物能夠預(yù)防太陽紫外輻射對人體皮膚造成的損傷［5］；此外，核桃雄花中氨基酸種類豐富，富含對人體有益的多種礦質(zhì)元素及維生素。目前對核桃的研究多集中于核桃仁、核桃殼、核桃青皮及核桃葉，而對核桃雄花的研究鮮有報(bào)道，市場上對核桃雄花的認(rèn)知度較低，對核桃花茶中的功能性成分及其沖泡工藝的研究很少。

多酚、黃酮具有清除自由基的功效，能夠預(yù)防及治療心腦血管、高血壓等多種慢性疾病，在臨床上應(yīng)用廣泛［6］，而游離氨基酸對茶葉品質(zhì)具有一定的影響，茶葉香氣和滋味均與之有關(guān)［7］，此外，游離氨基酸可被人體直接吸收，是VE、葉酸等營養(yǎng)素的良好來源［8］。浸提工藝會影響茶葉的相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)，考慮到溫度、時間及茶水比之間的交互作用尚不明確，且核桃花茶中的主要溶出物含量尚無數(shù)據(jù)支撐，本文依據(jù)其產(chǎn)量高、儲存時間短、開發(fā)利用度低以及營養(yǎng)價值高的特點(diǎn)，將核桃雄花按照制茶工藝制成核桃花茶，采用單因素試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析對核桃花茶浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化［9］。為核桃雄花的開發(fā)利用提供一定的理論指導(dǎo)，對核桃花茶的浸提工藝進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻核桃‘京藝1 號’雄花，河北省河北綠嶺有限公司生產(chǎn)基地（東經(jīng)114°4′，北緯37°3′）。

沒食子酸及蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、水合茚三酮、福林酚 北京索萊寶科技有限公司；Al（NO3）3、NaOH、NaNO2、Na2CO3、無水乙醇等試劑，福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700PC 紫外可見分光光度計(jì)，上海美析儀器分析有限公司；DD-8M2 冷風(fēng)機(jī)，大華制冷設(shè)備有限公司大華制冷設(shè)備廠；LG10 型冷凍干燥機(jī)，新陽速凍設(shè)備制造有限公司；高速萬能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃花茶的制備 選擇新鮮的核桃雄花水洗、瀝干，經(jīng)真空冷凍干燥后，置于粉碎機(jī)中粉碎，炒青，備用。

1.3.2 核桃花茶主要成分的測定

（1）多酚含量的測定

多酚含量的測定采用福林酚比色法［10］，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量（mg/g 干物質(zhì)）來表示，每個處理重復(fù)3 次。

（2）黃酮含量的測定

黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉—硝酸鋁比色法［11］，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以蘆丁當(dāng)量（mg/g 干物質(zhì)）來表示，每個處理重復(fù)3 次。

（3）游離氨基酸含量的測定

游離氨基酸含量的測定參照GB/T 8314—2013 ＜茶：游離氨基酸總量的測定＞，每個處理重復(fù)3 次。

1.3.3 單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 分別考察時間、溫度、茶水比對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響，試驗(yàn)過程如下：準(zhǔn)確稱取1 g 制備好的核桃花茶于茶包中，在浸提時間（5、10、15、20、25、30、35、45、60 min），茶水比（1∶50、1∶75、1∶100、1∶125、1∶150、1∶175、1∶200 g/mL）， 浸提溫度（60、70、80、90、100 ℃）的條件下浸提，浸提結(jié)束后過濾并準(zhǔn)確移取一定體積的浸提液，分別對比分析各因素不同水平的測定結(jié)果。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，核桃花茶試驗(yàn)因素與水平參見表1。

表1 核桃花茶浸提液的因素和水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design of walnut flower tea extract

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x±s）來表示，每個處理重復(fù)3 次，利用Origin 86、Expert-Design 8.0.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸提時間對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響 多酚、黃酮等化合物會受到光、熱等物理化學(xué)反應(yīng)的影響，加工時間和加工方式都會影響食品中多酚、黃酮等化合物的提?。?2］，而浸提時間對核桃花茶中有效成分的提取也具有一定的影響。由圖1 可知，隨著浸提時間的延長，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量逐漸增加，黃酮與游離氨基酸浸提量隨浸提時間的延長增加明顯，而多酚浸提量隨時間的延長呈緩慢增長趨勢，45 min 時核桃花茶中的黃酮、游離氨基酸浸提量達(dá)到峰值，隨時間的延長不再有增長趨勢，反而有下降趨勢，研究結(jié)果與Bengardino 等人的研究結(jié)果［13］一致，提取時間太長會導(dǎo)致多酚、黃酮等化合物之間發(fā)生縮合反應(yīng)，部分多酚、黃酮等化合物會被氧化。

2.1.2 浸提溫度對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響 溫度會影響多酚、黃酮等化合物的溶出，適宜的溫度會加速分子的運(yùn)動，多酚、黃酮等分子的擴(kuò)散速率也會加快［14］，提取溫度會對化合物組成和生物活性產(chǎn)生影響［15］。在浸提時間為30 min，茶水比為1∶100，浸提溫度不同的條件下，核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸的浸提量影響不同。由圖2 可知，游離氨基酸隨浸提溫度的升高其浸提量變化不明顯，60 ～90 ℃平緩增長，90 ℃時呈降低的趨勢，而多酚、黃酮的浸提量隨溫度的升高，其浸提量逐漸增加，且變化趨勢基本一致，但溫度太高會導(dǎo)致雜質(zhì)的溶出且有益成分易遭到破壞，影響浸提物的質(zhì)量，因此本研究90 ℃的浸提溫度較適宜。

圖2 浸提溫度對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction of polyphenols, flavonoids and free amino acids in walnut staminate flower tea

2.1.3 茶水比對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響 茶水比會影響核桃花茶有效成分的溶出，多酚、黃酮通常與植物中的大分子物質(zhì)結(jié)合成穩(wěn)定的物質(zhì)，而不同體積分?jǐn)?shù)的溶劑會影響植物多酚的提取［16］，本試驗(yàn)探討浸提時間30 min，溫度80 ℃，茶水比不同的條件下對其浸提量的影響。由圖3 可知，隨著茶水比的增加，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量均呈先增加后減少的趨勢，當(dāng)茶水比為1∶100 時游離氨基酸、黃酮達(dá)到最大值，其中游離氨基酸含量為52.85 mg/g，黃酮含量為58.96 mg/g， 當(dāng)茶水比大于1∶100 時游離氨基酸及黃酮得率逐漸降低，而當(dāng)茶水比為1∶125 時，多酚含量達(dá)到最大值32.93 mg/g。這可能是由于隨著茶水比的增加，核桃花茶中的其他成分也隨之溶出，破壞了多酚、黃酮的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其浸提量有所降低。

圖3 茶水比對核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量的影響Fig.3 Effect tea-water ratio on extraction of polyphenols, flavonoids and free amino acids in walnut staminate flower tea

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定因素水平及范圍，以浸提溫度、茶水比、浸提時間為響應(yīng)變量，多酚、黃酮、游離氨基酸浸提量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，利用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對因素水平進(jìn)行編碼，結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 2 Response surface design and response values

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert 軟件對表2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到多酚浸提量Y1、黃酮浸提量Y2和游離氨基酸浸提量Y3對浸提溫度A，茶水比B和浸提時間C的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y1（mg/g）=40.75+4.74A+0.19B+2.06C+0.045AB+0.84AC+1.52BC-2.99A2-2.60B2-3.90C2

回歸結(jié)果分析見表3，表4，表5。

表3 核桃花茶多酚浸提回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial model for extraction of polyphenol from walnut staminate flower tea

表4 核桃花茶黃酮浸提回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model for extraction of flavone from walnut staminate flower tea

表5 核桃花茶游離氨基酸浸提回歸模型方差分析結(jié)果Table 5 Analysis of variance of quadratic polynomial model for extraction of free amino acids from walnut staminate flower tea

由表3 ～5 可知，溫度對多酚、黃酮及游離氨基酸的影響均為極顯著；時間對游離氨基酸的影響為顯著，對多酚、黃酮的影響較??；茶水比對多酚及黃酮的影響均表現(xiàn)為極顯著，對游離氨基酸的影響為顯著。通過響應(yīng)面建立的回歸模型可知：多酚浸提模型P＜0.000 4，而黃酮與游離氨基酸浸提模型P＜0.000 1，表明核桃花茶中主要溶出物的浸提回歸模型極顯著，且其失擬項(xiàng)均不顯著，表示核桃花茶中3 種有效成分的擬合度良好，試驗(yàn)誤差相對較少，其中多酚的浸提回歸模型擬合度為0.961 5，黃酮的浸提回歸模型擬合度為0.991 2，游離氨基酸回歸模型擬合度0.976 2，因此核桃花茶中的多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量可以用此模型來分析和預(yù)測。

2.2.3 響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化 兩變量交互作用的顯著性可以用三維響應(yīng)面圖和二維輪廓圖來表示，圓形表示變量間交互作用不顯著，橢圓形與之相反，響應(yīng)面圖坡度越陡，響應(yīng)指標(biāo)對響應(yīng)因素的變化影響越大［17］。本試驗(yàn)固定不變其他試驗(yàn)因素，考察交互項(xiàng)對浸提效果的影響。由回歸方程可繪制核桃花茶多酚、黃酮及游離氨基酸的響應(yīng)面及等高線圖，如圖4 ～6 所示。

當(dāng)浸提時間為40 min 時，由圖4 可知，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量隨著浸提溫度和茶水比的升高和增加而增加，其中游離氨基酸浸提量在溫度95 ℃左右時較為穩(wěn)定，隨著浸提溫度的繼續(xù)升高，浸提量變化不明顯，多酚、黃酮的浸提量變化趨勢一致，溫度越高浸提量越多，但溫度超過95 ℃會有降低趨勢，這是因?yàn)闇囟忍邥?dǎo)致多酚、黃酮類物質(zhì)分解，影響浸提效果，而適當(dāng)?shù)纳邷囟葎t可以加劇分子運(yùn)動，提高浸提得率［18-19］。由圖4 中的等高線圖可以看出，溫度和茶水比對黃酮及游離氨基酸的浸提量交互作用顯著，而多酚浸提量隨溫度上升變化較為緩慢，交互作用不顯著。

當(dāng)茶水比為1∶100（g/mL）時，由圖5 可知，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量隨著浸提溫度的上升而增加，其中多酚及游離氨基酸浸提量在溫度95 ℃ 左右時較為穩(wěn)定，隨著浸提溫度的繼續(xù)升高，浸提量變化不明顯，而黃酮浸提量隨著浸提溫度的升高，浸提量有著微弱的下降趨勢，隨著浸提時間的延長，在40 min 前浸提量均有著增長的趨勢，之后浸提量不會有所增長反而有明顯下降趨勢，這是因?yàn)殡S著時間的延長，多酚黃酮類化合物達(dá)到飽和而受到 空氣中氧氣的影響，其含量有微弱的下降趨勢［20］。由圖5 中的等高線圖我們可以看出，浸提溫度對核桃花茶浸提物的影響較浸提時間更為顯著；溫度和時間對黃酮浸提量交互作用顯著，而對多酚及游離氨基酸交互作用不顯著。

圖4 核桃花茶浸提過程中溫度和茶水比交互作用對浸提量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot showing the effect of temperature and water ratio on extraction volume from walnut staminate flower tea

圖5 核桃花茶浸提過程中溫度和時間交互作用對浸提量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot showing the effect of temperature and time on extraction volume from walnut staminate flower tea

當(dāng)浸提溫度為90 ℃時，由圖6 可知，多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量隨著茶水比的增加而增加，其中游離氨基酸含量在茶水比1∶95 g/mL 左右時保持穩(wěn)定，隨著浸提時間的延長，浸提量變化不明顯， 有研究表明茶水比越大，有效成分的浸提率越低，這是由于隨著茶水比的增加受茶湯中的其他溶出物影響所致［21］。隨著浸提時間的延長，多酚浸提量變化較為明顯而黃酮浸提量變化不明顯，其中多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量隨時間的延長增加之后有著顯著的下降趨勢，且茶水比的高低與這種趨勢無關(guān)。

圖6 核桃花茶浸提過程中茶水比和時間交互作用對浸提量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot showing the effect of ter-water ratio and time on extraction volume from walnut staminate flower tea

由圖6 中的等高線圖可以看出，浸提時間比茶水比對核桃花茶主要溶出物的影響作用更為顯著；多酚浸提量在茶水比1∶90 之前，茶水比較浸提時間影響作用顯著，之后則相反，而游離氨基酸與黃酮浸提量受茶水比的影響較顯著。

利用 Design-Expert 對核桃花茶中的多酚、黃酮及游離氨基酸的浸提模型進(jìn)行計(jì)算，將響應(yīng)值重要性設(shè)定為同等重要，選取模型最優(yōu)浸提工藝為：浸提溫度96.83 ℃，茶水比1∶99.66 g/mL，浸提時間41.82 min，在此條件下多酚浸提量為42.98 mg/g， 黃酮浸提量為69.28 mg/g，游離氨基酸提取量為67.98 mg/g。

檢驗(yàn)所得結(jié)果的可靠性，在上述優(yōu)化后的浸提條件下對核桃花茶進(jìn)行浸提，結(jié)合茶葉沖泡的實(shí)際條件，將浸提工藝參數(shù)修正為：浸提溫度97 ℃，茶水比1∶100 g/mL，浸提時間42 min。在此條件下重復(fù)浸提3 次，實(shí)際測得多酚浸提量為42.01 mg/g， 黃酮浸提量為68.16 mg/g，游離氨基酸浸提量為67.14 mg/g，與理論預(yù)測值相比，多酚的誤差率為0.97%，黃酮的誤差率為1.12%，游離氨基酸的相對誤差為0.84%。因此，基于響應(yīng)面所得的優(yōu)化浸提工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價值。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對核桃花茶中的浸提工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了核桃花茶的最優(yōu)工藝條件為：溫度97 ℃、時間42 min、茶水比1∶100 g/mL，在此條件下核桃花茶的主要溶出物多酚、黃酮及游離氨基酸浸提量較高，浸提效果最好，最優(yōu)工藝條件的實(shí)際值與模型預(yù)測值相近，驗(yàn)證了模型的可靠性。最佳沖泡條件下浸提的核桃花茶食用價值高，對于核桃雄花及其花茶的進(jìn)一步研究與開發(fā)具有重要意義；此外，可對不同品種核桃花茶的主要溶出物含量進(jìn)行比對分析，利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)對各品種核桃花茶進(jìn)行分類；對核桃花茶的品質(zhì)指標(biāo)具有一定的檢測意義。綜上，核桃花茶沖泡工藝的研究可以為消費(fèi)者及廣大研究者提供1種簡單、高效的沖泡條件。