葛琳涵，白少川，李雪梅，趙麗杰，喬 寧，李蘭會(huì),3

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.華裕農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北 邯鄲 056000； 3.河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001）

禽白血病病毒（Avian leukosis viruses，ALV）屬于α 逆轉(zhuǎn)錄病毒類［1］。根據(jù)致病性和感染宿主的不同，ALV 被劃分為A-J 7 個(gè)亞群，其中的A-D和J 亞群為外源ALV，E 亞群為內(nèi)源性白血病毒［1-2］，禽內(nèi)源白血病毒ALVE 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒［3］。內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒屬于逆轉(zhuǎn)座子的1 種類型，物種進(jìn)化過程中由逆轉(zhuǎn)錄病毒入侵脊椎動(dòng)物基因組經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)座復(fù)制克隆而形成，是病毒感染后的基因組殘骸。

內(nèi)源病毒表達(dá)調(diào)控改變宿主生理，以病毒位點(diǎn)特異方式形成宿主-病毒間的互作，內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒對宿主的正效應(yīng)產(chǎn)生新的適應(yīng)性遺傳變異和抗感染能力，負(fù)效應(yīng)導(dǎo)致腫瘤等疾病發(fā)生［4］。ev21是E型內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒中的1 種，前人研究發(fā)現(xiàn)ev21與萊航雞的慢羽表型連鎖，影響慢羽雞的特異免疫功能，導(dǎo)致慢羽萊航雞產(chǎn)蛋性能下降、死亡率升高［5］。而目前更多的研究發(fā)現(xiàn)，ev21并不與慢羽連鎖，并且有地方雞的慢羽品系表現(xiàn)出更高的生產(chǎn)性能以及免疫性能［6-7］。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒與宿主基因組進(jìn)化、基因調(diào)節(jié)等密切相關(guān)。然而，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)紊亂會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生，對蛋、肉雞的生長發(fā)育和生產(chǎn)有直接影響。因此，內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的活性需緊密調(diào)控，但其在宿主體內(nèi)的活性調(diào)控機(jī)制尚不明確。

有研究認(rèn)為，ALVE 的整合位置效應(yīng)可能使其轉(zhuǎn)錄失活，1.5%的ALVE 位于基因編碼區(qū)，遠(yuǎn)低于4.9%的隨機(jī)整合預(yù)期比例［8］，這也表明ALVE 的整合位置對其產(chǎn)生某種影響。本課題組已經(jīng)克隆獲得ev21的完整基因組序列，發(fā)現(xiàn)ev21的LTR 區(qū)及其側(cè)翼區(qū)對其轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控活性［9-10］，但家禽如何控制具有LTR 調(diào)控活性的ev21的轉(zhuǎn)錄而保持健康，這一問題的解決對揭示宿主與內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒的和諧進(jìn)化以及病毒的防控具有指導(dǎo)意義。該研究發(fā)現(xiàn)Z 染色體上的C＞T 突變與ev21整合的連鎖關(guān)系，為解決該科學(xué)問題提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

海蘭褐94 只、太行雞168 只、海蘭灰15 只和SPF 雞15 只，4 個(gè)品種共292 份血液DNA 樣品。

1.2 試劑

Easy pure 血液DNA 提取試劑盒，北京全式金生物有限公司；MobII 內(nèi)切酶和DNA Marker，大連寶生物工程有限公司；2×TaqMasterMix，康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物合成和測序由北京六合華大基因公司完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。SNP 位點(diǎn)的篩選和基因型檢測用引物擴(kuò)增區(qū)域見圖1。

表1 PCR 引物信息Table 1 Primers for PCR experiments

ev21整合位點(diǎn)側(cè)翼區(qū)SNP 位點(diǎn)篩選用引物P1s和P1a， 擴(kuò) 增Z 染 色 體 上g.10681684-10682477（NC_006127.5） 的794 bp 序 列。ev21側(cè) 翼 區(qū)SNP 位點(diǎn)基因型RFLP 檢測用引物P2s 和P2a，其產(chǎn)物位于g.10681679-10682288，ev21占位區(qū)（OS）和未占位區(qū)（US）均能獲得610 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物；P3s 和P3a 引物擴(kuò)增的1 ～356 bp 和357 ～ 1 036 bp 分別位于ev21基因組序列的5′末端和g.10681598-10682277，只有ev21整合的OS 區(qū)獲得1 036 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物。雞羽型鑒別用引物P4s 和P4a、性別鑒定P5s 和P5a、以及ev21陰陽性鑒定P6s 和P6a，及其PCR 反應(yīng)體系和條件分別參考文獻(xiàn)［7, 9, 11］。

圖1 ev21 整合側(cè)翼區(qū)SNP 測序和酶切檢測擴(kuò)增區(qū)域結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram for detection of SNP in ev21 flanking region

1.4 ev21 側(cè)翼區(qū)SNP 位點(diǎn)篩選的PCR 擴(kuò)增

篩 查ev21整 合 位 點(diǎn) 側(cè) 翼 區(qū)SNP 用794 bp 序列PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為Mix 25 μL，正反引物各 2 μL，模板5 μL，ddH2O 16 μL，該體系為50 μL體系。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸7 min，最終4 ℃終止反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物送上海美吉生物公司進(jìn)行測序。

1.5 SNP 位點(diǎn)基因型鑒定

1.5.1 OS 與US 共有區(qū)和OS 特異區(qū)的PCR 擴(kuò)增610 bp 和1 036 bp 序列分別擴(kuò)增OS 與US 共有區(qū)和OS 特異區(qū)，10 μL PCR 反應(yīng)體系：Mix 5 μL，引物分別為0.5 和0.4 μL，模板分別為1 μL 和0.4 μL， ddH2O 分別為3 和3.8 μL。PCR 反應(yīng)程序分別為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 和32 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，4 ℃終止反應(yīng)。

1.5.2 610 bp和1 036 bp酶切檢測 610 bp和1 036 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 μL 置于100 μL 離心管，加入內(nèi)切酶MboII 0.5 μL、10×L Buffer 2 μL、ddH2O15 μL， 12 000 r/min 離 心5 s 混 勻。37 ℃金 屬 浴1 h，取 8 μL 酶切產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 SNP 位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

利 用 在 線 軟 件TRANSFAC?Professional 中的Patch1.0(http://gene- regulation.com/cgi-bin/pub/programs/patch/bin/patch.cgi)預(yù)測分析C＞T 突變可能引起的轉(zhuǎn)錄因子變化。

2 結(jié)果和分析

2.1 ev21 整合上游側(cè)翼區(qū)SNP 篩選

794 bp 序列PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因測序。使用BioEdit 軟件比對分析79 個(gè)樣品的794 bp 測序峰圖，發(fā)現(xiàn)ev21 整合位點(diǎn)g.10681598 上游278 bp 處的C＞T 突變，位于雞Z 染色體的g.10681876 位點(diǎn)，存在3 種基因型：TT、CC 純合型和CT 雜合型（見圖2）。

圖2 794 bp 序列中C＞T 突變的測序峰圖 Fig.2 The peak map for C＞T mutation in 794 bp sequence

對C＞T 突變位點(diǎn)基因型進(jìn)行匯總，結(jié)果見表2。海蘭褐和海蘭灰分別有10 個(gè)和7 個(gè)ev21陽性個(gè)體，SNP 位點(diǎn)全部為TT 基因型；15 個(gè)和7 個(gè)ev21陰性個(gè)體，全部為CC 基因型。太行雞的24 個(gè)ev21陽性個(gè)體，基因型為CT 雜合型；16 個(gè)ev21陰性個(gè)體中12 個(gè)為CC 純合基因型，4 個(gè)CT 雜合基因型。由此推測， C＞T 突變的T 等位基因可能與ev21的整合存在連鎖關(guān)系。為進(jìn)一步明確ev21整合與該位點(diǎn)的連鎖關(guān)系，增加樣本數(shù)量，對C＞T 位點(diǎn)的基因型進(jìn)行酶切檢測。

表2 ev21 整合與C＞T 位點(diǎn)的基因型關(guān)系Table 2 Relation of ev21 insertion and C＞T mutation

2.2 ev21 側(cè)翼區(qū)C＞T 位點(diǎn)基因型酶切檢測

2.2.1 610 bp 產(chǎn) 物 酶 切 檢 測 OS 和US 共 有 區(qū)610 bp 的酶切結(jié)果見圖3。當(dāng)突變位點(diǎn)為C 等位基因的610 bp 序列，形成的TCTTC 序列被內(nèi)切酶MboⅡ識 別，610 bp 序 列 被 切 割 為209 和401 bp 2 條帶，這種基因型定義為CC 純合型；C＞T 突變位點(diǎn)為T 等位基因時(shí)，內(nèi)切酶MboⅡ不能識別TCTTT 序列，610 bp 序列不能被切割，定義為TT純 合 基 因 型；酶 切 后 為610 bp、209 bp 和401 bp 3 條帶的，定義為CT 雜合型。

圖3 610 bp 產(chǎn)物酶切凝膠檢測Fig.3 Gel detection of 610 bp product digestion

2.2.2 1 036 bp 產(chǎn)物的酶切檢測ev21陽性個(gè)體才能擴(kuò)增1 036 bp 條帶，對其進(jìn)行MboⅡ酶切后1 036 bp 序列保持完整序列（見圖4），得出ev21陽性個(gè)體在其整合位點(diǎn)OS 區(qū)上游278 bp 的C＞T位點(diǎn)全部為T 單倍型。

圖4 1 036 bp 產(chǎn)物酶切凝膠檢測Fig.4 Gel detection of endonuclease digestion for 1 036 bp sequence

2.2.3 不同品種雞羽型、性別和ev21與C＞T 位點(diǎn)基因型 雞的品種、性別、ev21整合性與C＞T 突變信息見表4。海蘭褐祖代和海蘭灰雞中ev21陽性的慢羽雞分別有18 和15 只，慢羽雞存在US 和OS 2 個(gè)拷貝，C＞T 位點(diǎn)610 bp 酶切檢測全部為TT 純合基因型，1 036 bp 酶切檢測全部為T 單倍型，說明ev21整 合 陽 性 的OS 區(qū)C＞T 位 點(diǎn) 為T 等 位 基因，而未占位US 區(qū)也為T 等位基因，所以海蘭系列ev21陽性種雞的C＞T 突變構(gòu)成USTOST單倍型。海蘭褐商品代和太行雞的陽性慢羽雞分別有29 和90 只，610 bp 酶切全部為CT 雜合型，1 036 bp 酶切為T 單倍型，構(gòu)成USCOST單倍型。另外，海蘭褐商品代和太行雞各有2 只和40 只陰性慢羽雞，其基因組的OS 區(qū)由于重組造成ev21缺失，從而使OS 區(qū)回復(fù)突變?yōu)閁S 區(qū)，所以慢羽ev21陰性雞存在2 個(gè)拷貝的US 區(qū)。其610 bp 酶切為CT 雜合型，1 036 bp 無擴(kuò)增產(chǎn)物，從而形成2 個(gè)US 區(qū)，構(gòu)成USCUST單倍型。

表4 雞的品種、性別、羽型和ev21 整合性與C＞T 位點(diǎn)基因型Table 4 Genotype of C＞T mutation in different breeds, feather types and ev21 integration of chickens

海蘭褐祖代、商品代、SPF 雞和太行快羽陰性雞分別有30、10、15 和35 只，快羽雞只存在US區(qū)或OS 區(qū)1 個(gè)拷貝，610 bp 酶切全部為CC 基因型，1 036 bp 無擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)成了USC單倍型。另外海蘭褐商品代和太行快羽陽性公雞各有5 和4 只，其610 bp 酶切全部為CT 雜合型，1 036 bp 酶切為T 單倍型，C＞T 突變形成了USC和OST2 種單倍型。

2.4 C＞T 突變引起的轉(zhuǎn)錄因子變化預(yù)測

利用在線工具TRANSFAC?Professional 分析C＞T 突變引起的轉(zhuǎn)錄因子變化，發(fā)現(xiàn)C 單倍型有CDC2、CDC25C、CCNA2，這3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子為調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)控元件，在細(xì)胞的G0 和G1 期發(fā)揮抑制作用，可能對ev21轉(zhuǎn)錄表達(dá)的致細(xì)胞腫瘤毒性起到強(qiáng)化作用［12］。而T 單倍型型有EN、GR、PR-alpha 和AR，EN 轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，預(yù)測起到ev21的轉(zhuǎn)錄表達(dá)抑制作用；GR、PR-alpha和AR 分別為糖皮質(zhì)激素受體、孕酮受體、雄激素受體轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮抗應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)等作用［13-15］。

3 討論和結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，快慢羽雞ev21整合位點(diǎn)上游 278 bp 處的C＞T 突變，在OS 和US 區(qū)構(gòu)成5 種單倍型?？煊痣u只包含ev21的OS 區(qū)或US 區(qū)，有2種單倍型分別為OST和USC型；慢羽雞包含OS 區(qū)和US 區(qū)2 個(gè)重復(fù)區(qū)域，有3 種單倍型，為慢羽陽性雞的USCOST單倍型，海蘭慢羽陽性種雞特異的USTOST單倍型，以及慢羽ev21陰性雞的USCUST單倍型，可能源于ev21的重組缺失，使OS 區(qū)回復(fù)突變?yōu)閁S 區(qū)，但C＞T 位點(diǎn)仍保留為T 單倍型。結(jié)果表明，ev21整合位點(diǎn)上游278 bp 處的C＞T 突變，ev21整合與T 等位基因連鎖。

3.1 內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒在宿主基因組整合的非隨機(jī)性

ev21整合域的OS 區(qū)存在保守的T 等位基因，這可能與保持內(nèi)源病毒在宿主機(jī)體內(nèi)的穩(wěn)定性有關(guān)。Boulliou 等發(fā)現(xiàn)US 區(qū)存在3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，分別被HaeⅢ、Hind Ⅲ和ApaL Ⅰ內(nèi)切酶識別，而這3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在OS 區(qū)不存在多態(tài)性，與本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的MobII 酶切位點(diǎn)特征一致，說明OS 區(qū)序列保守性與ev21的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或功能保守性有關(guān)。內(nèi)源性病毒基因組在宿主體內(nèi)的相對穩(wěn)定性表明其對基因組可塑性的誘導(dǎo)從而增強(qiáng)進(jìn)化適應(yīng)性，與宿主間存在長期進(jìn)化合作共生關(guān)系［16］。

Wallace 等利用全基因組測序數(shù)據(jù)和計(jì)算機(jī)流水線發(fā)現(xiàn)46 個(gè)人內(nèi)源病毒位點(diǎn)整合多態(tài)性與鄰近標(biāo)記的SNP 存在連鎖關(guān)系［17］。雖然一般認(rèn)為內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒在宿主基因組的整合是隨機(jī)的，但是宿主基因組序列對其整合可能具有內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制。外源病毒傾向于整合在細(xì)胞的開放染色體，尤其是蛋白編碼基因附近，盡管內(nèi)源病毒可能具有相似的生物偏好，Mason 等研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源白血病毒的整合并非隨機(jī)的［18］，人工或自然選擇可能會(huì)剔除有害的內(nèi)源病毒元件。本研究發(fā)現(xiàn)的T 等位基因與ev21整合的連鎖關(guān)系，一定程度證明了其整合的非隨機(jī)性。

3.2 C＞T突變引起的轉(zhuǎn)錄因子變化穩(wěn)定ev21 的整合

對C＞T 突變引起的轉(zhuǎn)錄因子變化預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，T 單倍型下增加了EN、GR、PR-alpha 和AR轉(zhuǎn)錄因子的可能結(jié)合，EN 發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用可能與機(jī)體細(xì)胞ev21的低轉(zhuǎn)錄表達(dá)及其低細(xì)胞毒性有關(guān)，GR、PR-alpha 和AR 的轉(zhuǎn)錄結(jié)合與宿主細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、抗應(yīng)激有關(guān)［19-20］，保證了ev21與雞宿主的和平共處共進(jìn)化表達(dá)。C 單倍型下增加了CDC2、CDC25C、CCNA2 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，發(fā)揮細(xì)胞分化抑制作用與ev21的細(xì)胞腫瘤致毒性病變有關(guān)［21-22］，導(dǎo)致宿主癌變致死。ev21陽性個(gè)體的C＞T 突變位點(diǎn)全部為T 單倍型，推斷認(rèn)為C 單倍型下的ev21具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，對細(xì)胞造成較強(qiáng)的癌變致死毒性，所以C 單倍型的ev21整合個(gè)體全部致死淘汰，而只有與ev21整合連鎖的T 單倍型個(gè)體被保留繁衍。當(dāng)然，其可能的機(jī)理還需試驗(yàn)驗(yàn)證。

OS 區(qū)上游278 bp C＞T 的T 突變型與ev21整合緊密連鎖，可能源于結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子改變影響ev21的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終使ev21感染的T 單倍型個(gè)體存活保留下來，而C 單倍型個(gè)體由于ev21的強(qiáng)毒性被淘汰。該研究發(fā)現(xiàn)為探究內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒與宿主的共進(jìn)化關(guān)系提供理論參考，為加速我國無內(nèi)源病毒的種禽的分子選育提供借鑒，關(guān)于C＞T 突變與ev21的轉(zhuǎn)錄表達(dá)間的調(diào)控關(guān)系有待進(jìn)一步研究。