徐大德 羅斯特 李彩欣

（1廣州工商學(xué)院物流系，廣東佛山528138；2肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶526062；3 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門361102）

黑眶蟾蜍（Bufo melanostictusSchneider）隸屬于兩棲綱Amphibia，無尾目Anura，蟾蜍科Bufonidae，蟾蜍屬Bufo［1］。主要分布在中國南部地區(qū)，包括云南、廣西、廣東、福建等地，在肇慶地區(qū)也屬于常見種類，其繁殖期一般在3～6月,以捕食昆蟲為主。黑眶蟾蜍能夠大量捕食危害農(nóng)林業(yè)的害蟲，對促進(jìn)農(nóng)業(yè)和林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及維持生態(tài)平衡有著重大作用［2］；其耳后腺分泌物可制成中藥“蟾酥”，被認(rèn)為有解毒消腫止痛等功效，因此黑眶蟾蜍具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。目前對于黑眶蟾蜍的研究報道主要有通過鹽度、酸堿度、重金屬、水等環(huán)境因子實(shí)驗(yàn)對其適應(yīng)性影響，其中溫度是調(diào)控生物形態(tài)發(fā)育、生理變化、行為適應(yīng)和生存繁衍等重要的環(huán)境因子［3-7］。本實(shí)驗(yàn)以溫度為調(diào)控因子，研究最適溫度、逃避溫度及致死溫度對黑眶蟾蜍蝌蚪生長發(fā)育的影響，為黑眶蟾蜍的人工繁殖提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以黑眶蟾蜍蝌蚪為實(shí)驗(yàn)材料，樣品于2019 年4 月10 日采自肇慶學(xué)院生物園, 約20 日齡，體重0.064±0.013 g，體長1.126±0.035 cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

把采集到的蝌蚪各50 尾放入裝有800 ml 原蝌蚪生活用水的3個1 000 ml的大燒杯里，放在溫度分別為9℃、16℃和23℃的恒溫培養(yǎng)箱中，馴化培養(yǎng)兩周。馴化期間以蛋黃飼養(yǎng)，每兩天換水一次，每次換去2/3，并撈出代謝廢物及殘渣。用溫度梯度水槽裝置進(jìn)行記錄蝌蚪的最適溫度和逃避溫度。溫度梯度水槽裝置由一個170 cm的玻璃水槽、冰水浴和溫水浴組成（圖1）。在玻璃水槽里注入約3 cm的自來水，水槽一端放置裝有熱水的陶瓷杯（溫度為80℃），另一端放置冰袋，約2 h 內(nèi)形成一系列的溫度梯度。將同一馴化溫度的蝌蚪，放入溫度梯度水槽的中間位置（水溫約24℃），30 min 后，用點(diǎn)溫記（UT-325）測定蝌蚪所在位置的水溫。以所有蝌蚪個體出現(xiàn)頻率最高的位置或長時間停留的位置溫度定為最適溫度。將黑眶蟾蜍蝌蚪在水槽里游行時，掉轉(zhuǎn)身體逃避時所在位置的溫度定為逃避溫度，同時將蝌蚪表現(xiàn)出亂撞、緊張、急躁等異常行為時所在位置的溫度也定義為逃避溫度。致死溫度為采用恒溫水浴鍋逐漸升高溫度直至蝌蚪死亡時的溫度值。

圖1 溫度梯度模擬裝置Fig.1 The simulation apparatus for temperature gradient

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對所有采集到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Statistica進(jìn)行統(tǒng)計,進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析，將顯著水平設(shè)在α＝0.05。

馴化反應(yīng)速率(Acclimation response ratios,ARRs)以馴化反應(yīng)總的溫度變化除以忍耐溫度變化量表示［8］。其計算方法如下：

最適溫度的ARRs=(23-9)/(23℃馴化下的最適溫度-9℃馴化下的最適溫度)；

逃避溫度的ARRs=(23-9)/(23℃馴化下的逃避溫度-9℃馴化下的逃避溫度)

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 最適溫度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示受馴化溫度影響，不同條件下的最適溫度存在差異。在9℃條件下，黑眶蟾蜍蝌蚪的最適溫度是17.3℃（15.2～21℃）；在16℃條件下，其最適溫度是24.0℃（20～28.2℃）；在23℃條件下，其最適溫度是25.6℃（22～29℃）。黑眶蟾蜍蝌蚪的最適溫度范圍、最適溫度會隨著馴化溫度的升高而遞增（圖2）。統(tǒng)計結(jié)果表明黑眶蟾蜍蝌蚪的最適溫度在不同的馴化溫度下存在顯著差性（F2,49=231.4，P＜0.05）。

圖2 不同馴化溫度下黑眶蟾蜍蝌蚪的最適溫度Fig.2 The optimum temperature of Bufo melanostictus tadpoles at different temperatures

2.2 逃避溫度

黑眶蟾蜍蝌蚪在9℃、16℃及23℃三個不同的溫度馴化下的逃避溫度影響也存在差異。在9℃、16℃和23℃馴化溫度下，其逃避溫度分別為26.4℃、31.3℃和33.5℃。單因素方差結(jié)果顯示黑眶蟾蜍蝌蚪的逃避溫度在這三個馴化溫度下存在顯著性差異（F2,49=141.87，P＜0.05）。本研究結(jié)果表明，可通過適當(dāng)提高馴化溫度來提高蝌蚪增強(qiáng)對溫度變化的抗性，從而使其更好地適應(yīng)高溫環(huán)境影響。

2.3 致死溫度

黑眶蟾蜍蝌蚪的高溫致死溫度范圍是38～41℃，低溫致死溫度為2℃（表1、表2），統(tǒng)計結(jié)果顯示，溫度馴化差異對黑眶蟾蜍蝌蚪的致死溫度無顯著差影響（F2,49=2.03，P＞0.05）。

表1 黑眶蟾蜍蝌蚪的高溫死亡率Table 1 The mortality of Bufo melanostictus tadpoles in high temperature treatment

表2 黑眶蟾蜍蝌蚪的低溫死亡率Table 2 The mortality of Bufo melanostictus tadpoles in low temperature treatment

（四）馴化反應(yīng)速率

本研究結(jié)果顯示，馴化溫度對黑眶蟾蜍蝌蚪最適溫度的影響要強(qiáng)于對其逃避溫度的影響（表3）。

表3 黑眶蟾蜍蝌蚪的馴化溫度反應(yīng)率（ARRs）Table 3 The acclimation response ratios of Bufo melanostictus tadpoles

3討論

已有大量的研究表明在自然環(huán)境條件下，溫度變化會顯著影響兩棲動物的生長發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)中黑眶蟾蜍蝌蚪在不同溫度馴化下，通過調(diào)節(jié)自身溫度對環(huán)境改變做出適應(yīng)性選擇。黑眶蟾蜍蝌蚪的最適溫度受到馴化溫度的影響而變化，本實(shí)驗(yàn)中在9℃、16℃、23℃的馴化下，黑眶蟾蜍蝌蚪的最適溫度分別為17.3℃、24℃和25.6℃。單因素方差分析(F2,49=231.4,P＜0.05)，說明馴化溫度對黑眶蟾蜍蝌蚪的最適溫度有著顯著影響，在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中可以提高黑眶蟾蜍蝌蚪的馴化溫度來提高其對高溫的適應(yīng)性［8］。

馴化溫度對黑眶蟾蜍蝌蚪的逃避溫度的影響差異性顯著，隨著馴化溫度的提高，黑眶蟾蜍蝌蚪逃避溫度在一定范圍內(nèi)提高，在9℃、16℃和23℃馴化下蝌蚪的逃避溫度分別為26℃、31.3℃和35℃，該結(jié)果與中國林蛙蝌蚪（Rana chensinensis）和大蟾蜍蝌蚪（Bufo gargarizans）熱忍受溫度隨著馴化溫度提高而有提高報道相似［8］。這種現(xiàn)象同樣存在于其他的外溫動物的研究報道中［9］。

與前人對中國林蛙蝌蚪的熱耐受性研究結(jié)果相比，可看到這兩種蛙類的幼體在熱耐受性上存在種間差異，這種差異可能代表了兩種蛙類各自獨(dú)特的生理特質(zhì)，反映了不同地區(qū)的長期溫度差異對其熱耐受性的自然馴化［10］。具體表現(xiàn)為低溫致死溫度為2℃（黑眶蟾蜍）和0℃（中國林蛙）；高溫致死溫度是39℃（黑眶蟾蜍）和37～38℃（中國林蛙）。由此可見黑眶蟾蜍蝌蚪的低溫耐受性要弱于中國林蛙蝌蚪，而高溫耐受性要強(qiáng)于中國林蛙蝌蚪。本研究認(rèn)為這種溫度耐受性的差異原因可能是長期自然選擇的結(jié)果：由于黑眶蟾蜍主要分布在華南地區(qū)，氣候相對潮濕炎熱，因而黑眶蟾蜍相對于中國林蛙蝌蚪的高溫耐受性高［1］；而中國林蛙蝌蚪主要分布在中國的東北地區(qū)，冬季寒冷干燥，所以中國林蛙蝌蚪相對低溫的適應(yīng)性要強(qiáng)于黑眶蟾蜍蝌蚪［11］。因此通過對蛙類幼體進(jìn)行熱耐受性調(diào)節(jié)，能提高其對環(huán)境溫度波動的適應(yīng)性，具有非常重要的生態(tài)學(xué)意義［10］。

在馴化范圍內(nèi)（9～23℃），黑眶蟾蜍蝌蚪的馴化反應(yīng)速率ARRs表現(xiàn)為最適溫度大于逃避溫度，該結(jié)果表明黑眶蟾蜍蝌蚪在一定馴化溫度范圍內(nèi)，其最適溫度的耐受性受馴化溫度的影響程度比逃避溫度耐受性受馴化溫度影響程度大。本實(shí)驗(yàn)研究表明黑眶蟾蜍蝌蚪最適溫度比逃避溫度在環(huán)境溫度變化上所產(chǎn)生的生理反應(yīng)能力強(qiáng)。