周 瑜，楊寶田

林蛙又稱棕色蛙(Brown Frog)，隸屬于無(wú)尾目(Anura)蛙科(Ranidae)林蛙屬(Rana)，主要分布于歐亞大陸溫帶地區(qū)至中國(guó)、印度一帶和北美南部地區(qū)［1］。中國(guó)的林蛙物種資源豐富，包括中國(guó)林蛙種組(Rana chensinensis species group)、長(zhǎng)肢林蛙種組(Rana longicrus species group)和黑龍江林蛙種組(Rana amurensis species group)［2］。中國(guó)分布的林蛙屬物種約有17個(gè)，包括近年發(fā)表的新種徂徠林蛙(Rana culaiensis)［3］、貓兒山林蛙(Rana maoershanensis)［4］和 Rana jiemuxiensis［5］。

由于形態(tài)特征的相似性，林蛙屬各物種的識(shí)別較為困難［6］。近年來，隨著DNA序列分析技術(shù)的迅速發(fā)展，其在物種和個(gè)體識(shí)別、親緣關(guān)系鑒定以及分子進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析等諸多方面顯示了極大的優(yōu)勢(shì)，從而得到了廣泛的應(yīng)用。由于母系遺傳和不存在重組過程的特點(diǎn)，線粒體DNA在很多動(dòng)物研究中被證明能夠很好地展現(xiàn)物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系［7］。在對(duì)林蛙屬物種的遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究中，線粒體DNA細(xì)胞色素b(Cyt b)基因都被視為很好的指示序列［8］。細(xì)胞色素氧化酶I(COI)基因作為DNA條形碼標(biāo)識(shí)序列，在兩棲類物種鑒定方面也得到廣泛關(guān)注［9－10］。中國(guó)林蛙屬物種關(guān)系復(fù)雜，前人的相關(guān)研究主要集中在對(duì)某一個(gè)種組內(nèi)部的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系的分析，包括近年新發(fā)現(xiàn)物種在內(nèi)的較全面的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

本研究應(yīng)用Cyt b基因和COI基因序列分析對(duì)林蛙屬物種進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)相關(guān)物種的有效性，全面分析中國(guó)分布林蛙屬物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣本收集、基因組提取與PCR擴(kuò)增

本研究所收集的中國(guó)分布的林蛙屬物種樣本及來源見表1。樣本從野外采集經(jīng)鑒定后取肌肉或肝臟組織置于75%乙醇保存?zhèn)溆?。采用SDS/蛋白酶K裂解，酚－氯仿抽提法提取組織中的總DNA［11］。

R .kunyuensis SYNU07050112 Mt.Kunyu，Shandong，China KF020609 KF020624 SYNU07050130 Mt.Kunyu，Shandong，China KF020610 KF020625 R.chensinensis KIZRD05SHX01 Huxian，Shaanxi JF939080 JN984335 SYNU－h(huán)ld1 Huludao，Liaoning KF020612 KF020627 R.dybowskii KIZ070423448 Huangnihe，Jilin JF939078 JF939116 SYNU07040020 Huanren，Liaoning Unpublished Unpublished SYNU13070055 Xiuyan，Liaoning Unpublished Unpublished SYNU13070053 Mt.Guanmenshan，Liaoning Unpublished Unpublished R.huanrensis SYNU040006 Huanren，Liaoning JF939072 JN984545 SYNU07040035 Huanren，Liaoning Unpublished KF204668 R.kukunoris CJ06102001 Qinghai Lake，Qinghai JF939073 JN984213 Outgroup Pelophylax nigromaculatus AB043889 Lithobates catesbeianus AB761267

PCR 擴(kuò)增引物參考 Zhou 等(2012)［12］，Tanaka－Ueno 等(1999)［13］，Che 等(2012)［9］(表 2)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行94℃變性30s、46℃退火30s、72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物由北京六合華大基因有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，以確保序列的準(zhǔn)確性。

1.2 DNA序列數(shù)據(jù)處理和系統(tǒng)發(fā)育分析

所測(cè)得序列用DNAStar 7.0進(jìn)行雙向測(cè)序結(jié)果的拼接及序列校對(duì)，并結(jié)合由Yan等(2011)［5］發(fā)表的數(shù)據(jù)資源，使用ClustalX 1.81軟件［14］進(jìn)行多重序列比對(duì)。將兩個(gè)基因片段合并一起進(jìn)行分析。p－distance計(jì)算使用 MEGA5.1 軟件［15］。

以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中黑斑側(cè)褶蛙(Pelophylax nigromaculatus)和美國(guó)牛蛙(Lithobates catesbeianus)為外群［16－17］，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)和貝葉斯法(Bayesian inference，BI)分別對(duì)線粒體基因構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。用RAxML 7.0.4軟件［18］執(zhí)行rapid－h(huán)ill－climbing運(yùn)算法則構(gòu)建ML樹，并進(jìn)行1000次擬重復(fù)抽樣的bootstrap分析，以檢驗(yàn)各節(jié)點(diǎn)的置信度。用MrBayes 3.1.2［19］軟件構(gòu)建貝葉斯樹，以隨機(jī)樹為起始樹，4條馬爾可夫鏈運(yùn)行1000萬(wàn)代，每1000代抽樣并保存數(shù)據(jù)一次，舍棄老化25%樣本后，根據(jù)剩余樣本構(gòu)建合意樹。分析過程中對(duì)兩個(gè)基因片段分別按第一密碼子、第二密碼子和第三密碼子使用獨(dú)立模型進(jìn)行分析。ML樹采用GTRCAT模型，BI樹的最佳堿基替換模型由 MrModeltest 2.3［20］軟件分析得出表3。

表2 引物序列

表3 使用MrModeltest軟件分析得到的各分區(qū)數(shù)據(jù)ACI堿基替代模型

2 結(jié)果

2.1 序列分析

實(shí)驗(yàn)測(cè)得Cyt b基因片段長(zhǎng)度≥629bp，COI基因片段長(zhǎng)度～560bp。Kartavtsev和 Lee(2006)［21］基于大量樣本分析了Cyt b基因片段與COI基因片段在種內(nèi)、近緣物種之間、屬內(nèi)各物種間及屬間的p－distance變化范圍。其中近緣物種間的p－distance值為Cyt b:5.52±1.34，COI:4.91±0.83。為了探討中國(guó)分布的林蛙物種種間關(guān)系，我們也對(duì)Cyt b基因和COI基因片段序列數(shù)據(jù)進(jìn)行了種間p－distance分析(表4)。分析結(jié)果顯示，除徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙之間的p－distance(Cytb:2.7;COI:2.7)和徂徠林蛙與長(zhǎng)肢林蛙COI基因間p－distance(COI:3)較低外，其余中國(guó)分布林蛙屬物種種間p－distance大于近緣物種之間p－distance(Cytb:4.9～24.2;COI:4.4 ～23.3)。徂徠林蛙與長(zhǎng)肢林蛙 p－distance值介于 Kartavtsev和 Lee(2006)［21］分析的種內(nèi)與相近物種之間。貓兒山林蛙與其他林蛙屬物種的p－distance結(jié)果顯示，貓兒山林蛙與長(zhǎng)肢林蛙種組物種關(guān)系較近，最近為昭覺林蛙。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

分析構(gòu)建的ML樹和BI樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致(圖1)。從圖1中可以看出:(1)除徂徠林蛙(Bayesian posterior probabilities，PP=0.73;bootstrap values，BS=0.79)外，其他林蛙物種的單系性均得到了肯定(PP=1.0;BS=1.0);(2)3個(gè)林蛙種組中黑龍江林蛙種組與中國(guó)林蛙種組的單系性得到支持(PP=1.0;BS=1.0)，除貓兒山林蛙以外的長(zhǎng)肢林蛙種組單系性也得到支持(PP=1.0;BS=1.0);(3)系統(tǒng)發(fā)育樹還顯示貓兒山林蛙與黑龍江林蛙種組構(gòu)成姊妹群，但支持度較低(PP=0.52;BS=0.28)。

ML樹與BI樹結(jié)構(gòu)的不同之處為:(1)ML樹顯示3個(gè)種組間關(guān)系為中國(guó)林蛙種組與黑龍江林蛙種組加貓兒山林蛙組成的群系首先構(gòu)成姊妹群，再與長(zhǎng)肢林蛙種組合并，而在BI樹中這3個(gè)并列支系構(gòu)成了多歧樹;(2)在長(zhǎng)肢林蛙種組中，ML樹由徂徠林蛙、鎮(zhèn)海林蛙和長(zhǎng)肢林蛙構(gòu)成的支系先與R.jiemuxiensis結(jié)合，再與由峨眉林蛙和寒露林蛙構(gòu)成的支系結(jié)合。BI系統(tǒng)樹則為R.jiemuxiensis與上述兩個(gè)支系構(gòu)成并系的多歧樹。

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圖1 基于線粒體COI基因和Cyt b基因聯(lián)合分析的ML樹(圖左)和貝葉斯樹(圖右)

3 討論

3.1 物種有效性評(píng)價(jià)

基于COI和Cyt b基因片段的林蛙屬物種間遺傳距離分析結(jié)果表明，除徂徠林蛙與鎮(zhèn)海林蛙間p－distance值較小外，其余林蛙物種間p－distance值均大于Kartavtsev and Lee(2006)界定的種間p－distance值。系統(tǒng)發(fā)育樹也證實(shí)，除徂徠林蛙外，其余林蛙物種的單系性得到支持。所以研究認(rèn)為徂徠林蛙的物種有效性和分類地位有待進(jìn)一步全面與鎮(zhèn)海林蛙和長(zhǎng)肢林蛙進(jìn)行聯(lián)合評(píng)估，包括幾個(gè)新種在內(nèi)的其余林蛙物種有效性均得到肯定。

貓兒山林蛙為L(zhǎng)u等(2007)［7］基于形態(tài)學(xué)分析發(fā)表的林蛙屬新物種，與長(zhǎng)肢林蛙種組物種形態(tài)更為相似。Yang等(2010)［22］基于線粒體16SrRNA基因片段對(duì)其分析結(jié)果顯示，貓兒山林蛙與中國(guó)林蛙互為姊妹群。Yan等(2011)［5］對(duì)長(zhǎng)肢林蛙種組物種進(jìn)行全面分析，結(jié)果顯示采自貓兒山地區(qū)的形態(tài)近似貓兒山林蛙的物種為寒露林蛙，并認(rèn)為貓兒山林蛙為寒露林蛙的同物異名。我們的研究結(jié)果表明雖然貓兒山林蛙在系統(tǒng)發(fā)育樹中的地位沒有得到完全解決，但貓兒山林蛙與其他林蛙物種較大的p－distance(Cyt b:15.9－23.3;COI:13.7－19.6)和系統(tǒng)發(fā)育樹均證明其并不是寒露林蛙的同物異名物種，貓兒山林蛙為有效物種。

3.2 系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系

中國(guó)林蛙種組的單系性得到支持。Zhou等(2012)［12］詳細(xì)研究了由中國(guó)林蛙、高原林蛙和桓仁林蛙組成的中國(guó)林蛙復(fù)合群(Rana chensinensis species complex)，中國(guó)林蛙復(fù)合群與東北林蛙構(gòu)成姊妹支系。長(zhǎng)肢林蛙種組的單系成立，但其內(nèi)部物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系復(fù)雜。本研究分析結(jié)果得到長(zhǎng)肢林蛙種組由(1)昭覺林蛙、(2)峨眉林蛙、(3)寒露林蛙、(4)R.jiemuxiensis和(5)徂徠林蛙、鎮(zhèn)海林蛙和長(zhǎng)肢林蛙5個(gè)亞支系構(gòu)成，但5個(gè)亞支系間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系沒能解決，有待進(jìn)一步研究。黑龍江林蛙種組的單系性被支持，由黑龍江林蛙與昆崳林蛙構(gòu)成的姊妹群組成。

貓兒山林蛙在系統(tǒng)發(fā)育樹中的地位雖與黑龍江林蛙種組較近，但是較大的p－distance值和系統(tǒng)樹中較低的節(jié)點(diǎn)支持度均表明貓兒山不屬于任何一個(gè)種組。其系統(tǒng)地位有待結(jié)合更大量的物種樣本和序列數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。

4 結(jié)論

(1)盡管貓兒山林蛙的系統(tǒng)發(fā)生地位沒有得到完全解決，但其并不是寒露林蛙的同物異名物種，即貓兒山林蛙為有效物種。(2)中國(guó)林蛙種組、黑龍江林蛙種組和長(zhǎng)肢林蛙種組的單系性得到肯定，長(zhǎng)肢林蛙種組物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系有待進(jìn)一步研究確定。

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