辛成龍

（山東省疾病預(yù)防控制中心，山東濟(jì)南 250000）

硒為人體必需的元素之一，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的組成部分，可以維持酶活性，富硒酵母為硒的補(bǔ)充制劑，其應(yīng)用廣泛，為《保健食品原料目錄（一）》中明確載明的保健食品原料之一，具有食用安全性，且經(jīng)科學(xué)證明，其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能[1-3]。張國(guó)蓉等[4]研究了富硒酵母對(duì)小鼠免疫功能的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明富硒酵母能夠顯著提高小鼠T和B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）活性和巨噬細(xì)胞的吞噬功能。

破壁靈芝孢子粉為衛(wèi)法監(jiān)發(fā)（2001）84號(hào)載明的可用于保健食品的真菌菌種名單中的靈芝孢子破壁而得。靈芝（Ganoderma lucidum）是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘等功效。靈芝孢子是靈芝在生長(zhǎng)成熟期，從靈芝菌褶中彈射出來(lái)的卵形生殖細(xì)胞，主要有效成分包括多糖、三萜、生物堿和甾醇等，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等作用[5-7]，其經(jīng)破壁之后，能促進(jìn)機(jī)體對(duì)其的吸收，從而大大提高功效。楊國(guó)光等[8]分別給予昆明種小鼠3種不同破壁方法的靈芝孢子粉，發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠給予3種破壁靈芝孢子粉30 d后，小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平、細(xì)胞抗體生成水平、血清溶血素抗體滴度水平、碳廓清吞噬功能均有不同程度的提高，表明3種破壁靈芝孢子粉均具有增強(qiáng)免疫力的作用。黃邵新等[9]探討了靈芝孢子粉對(duì)小鼠免疫功能的影響，給藥小鼠半數(shù)溶血值、血碳清除率、足跖厚差、脾臟指數(shù)與正常對(duì)照組相比差異顯著，表明靈芝孢子粉可較全面地提高小鼠的免疫功能。富硒酵母、破壁靈芝孢子粉二者配伍，可協(xié)同促進(jìn)增強(qiáng)機(jī)體免疫力?，F(xiàn)為證明二者的復(fù)方產(chǎn)品具有增強(qiáng)免疫力功效及安全性，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品

復(fù)方富硒酵母破壁靈芝孢子粉，2.5 g/袋，組方為富硒酵母（Se含量為0.5%）0.09 g、破壁靈芝孢子粉1.90 g、果粉0.51 g；每日2次，每次1袋。羊血、印度墨汁，由上海信裕提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

由山東大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供的ICR小鼠200只，SD大鼠80只，清潔級(jí)，♀♂兼用（每項(xiàng)功能試驗(yàn)均使用單性別小鼠），生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）20130009，試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（魯）20100011號(hào)。試驗(yàn)動(dòng)物飼料生產(chǎn)許可證SCXK（京）2014-0008。飼養(yǎng)環(huán)境為屏障級(jí)。試驗(yàn)環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%±10%。功能試驗(yàn)中，將160只小鼠按體質(zhì)量分為4個(gè)免疫大組，每大組40只，每免疫大組小鼠分為水對(duì)照組以及上述樣品低、中、高劑量組，各10只。免疫一組（雌）用于遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）實(shí)驗(yàn)、血清溶血素的測(cè)定、抗體生成細(xì)胞數(shù)的測(cè)定；免疫二組（雌）用于小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)；免疫三組（雄）用于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；免疫四組（雄）用于小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和小鼠自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）活性測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)劑量

本樣品人體推薦劑量為5.0 g/日，人體按體重60 kg計(jì)，設(shè)置低、中、高3個(gè)劑量組，分別為0.42 g/kg.BW、0.83 g/kg.BW、2.5 g/kg.BW，相當(dāng)于人體推薦劑量的5倍、10倍、30倍，經(jīng)口給予受試物，每日灌胃一次，灌胃體積按20 mL/kg.BW。灌胃前用蒸餾水配制受試物，對(duì)照組以等體積的蒸餾水代替受試物，連續(xù)給予30 d后檢測(cè)各項(xiàng)免疫指標(biāo)。小鼠以遠(yuǎn)交系小鼠專(zhuān)用飼料喂飼。

1.4 儀器設(shè)備

ACS-3A動(dòng)物天平，上海越衡；Bp-3100S分析天平，德國(guó)賽多利斯；WIGGENS WCI-180N CO2培養(yǎng)箱，伊孚森中國(guó)；RTS-0506恒溫水浴，南京舜瑪；Mikro-22臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)赫提馳；P9雙光束紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)；MR-96A酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，深圳邁瑞；光學(xué)顯微鏡，無(wú)陌光學(xué)；JC-ZF-RE5000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，聚創(chuàng)環(huán)保。血細(xì)胞計(jì)數(shù)器、24孔和96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔U型底細(xì)胞培養(yǎng)板、計(jì)時(shí)器、血色素吸管、游標(biāo)卡尺（精密度0.01 mm）。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 臟器體重比值測(cè)定

小鼠稱(chēng)重后頸椎脫臼處死小鼠，取其胸腺、脾臟，經(jīng)處理后稱(chēng)重，計(jì)算胸腺體重比值與脾臟體重比值。

1.5.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射2%（V/V，用生理鹽水配制）壓積綿羊紅細(xì)胞SRBC（2 000 r/min，10 min）0.2 mL，致敏后 4 d，測(cè)量左后足跖部厚度，同一部位測(cè)量3次，取其平均值。然后在測(cè)量部位皮下注射20%（V/V，用生理鹽水配制）壓積SRBC 20 μL，于注射后24 h測(cè)量左后足跖部厚度，以攻擊前后足跖厚度之差值（足跖腫脹度）來(lái)表示DTH的程度。

1.5.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法）

小鼠喂養(yǎng)30 d后無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌Hank's液的小平皿中，制成細(xì)胞懸液，分為兩份，一份加入ConA液，另一孔作為對(duì)照組。每份加入酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值（A值）。計(jì)算試驗(yàn)孔A值與對(duì)照孔A值之差，以此表示淋巴細(xì)胞的增殖能力。

1.5.4 抗體生成細(xì)胞測(cè)定（Jerne改良玻片法）

取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射壓積SRBC，將SRBC免疫5 d后的小鼠處死，取脾，制成細(xì)胞懸液，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，進(jìn)行培養(yǎng)箱孵育、溫育后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.5.5 小鼠血清溶血素的測(cè)定

取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每只鼠經(jīng)腹腔注射壓積SRBC，免疫5 d后，摘除小鼠眼球取血離心，將凝固血與管壁剝離，收集血清，孵育，記錄血球凝集程度，計(jì)算抗體積數(shù)。

1.5.6 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

小鼠尾靜脈注射1∶5稀釋的印度墨汁，待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)，注入墨汁后2 min、10 min，分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并將其加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。用紫外分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值（A），以Na2CO3溶液作空白對(duì)照。將小鼠處死，取其肝臟和脾臟稱(chēng)重。按公式（1）計(jì)算吞噬指數(shù)a，其中k根據(jù)公式（2）計(jì)算。

式（2）中，A1為t1時(shí)刻的測(cè)得的吸光度，A2為t2時(shí)刻測(cè)得的吸光度。

1.5.7 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（半體內(nèi)法）

小鼠腹腔注射20%壓積雞紅細(xì)胞懸液，頸椎脫臼處死，取腹腔巨噬細(xì)胞洗液孵箱溫育、漂洗、晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4% Giemsa-磷酸緩沖液染色5 min，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下計(jì)數(shù)，每片計(jì)數(shù)100個(gè)巨噬細(xì)胞，按公式（3）和公式（4）計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)。

所得數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，吞噬百分率需按X=Sin-1進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，式中P為吞噬百分率，用小數(shù)表示。

1.5.8 小鼠NK細(xì)胞活性測(cè)定[乳酸脫氫酶（ LDH）測(cè)定法]

將小鼠脫臼處死，無(wú)菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，用Hank's液洗，離心，重懸，用1%冰醋酸稀釋后計(jì)數(shù)（活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95%以上），調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL，使效靶比為50∶1。取靶細(xì)胞和脾細(xì)胞各100 μL，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板，靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%乙基苯基聚乙二醇（NP40）各100 μL，上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)平行孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，將96孔板以1 500 r/min離心5 min，每孔吸取上清液100 μL置96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)10 min，然后每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定A值，按公式（5）計(jì)算NK細(xì)胞活性。

1.5.9 毒理試驗(yàn)

（1）小鼠急性毒性試驗(yàn)

采用最大耐受劑量法試驗(yàn)，小鼠灌胃前16 h禁食（自由飲水），于第2 d以20.0 g/kg.BW灌胃受試物后，連續(xù)觀察14 d，并及時(shí)記錄小鼠的中毒癥狀、死亡情況。

（2）大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

選擇80只SD大鼠，按體重隨機(jī)分成4組，每組20只，雌雄各半。設(shè)2.5 g/kg.bw、5.0 g/kg.bw、10.0 g/kg.bw三個(gè)劑量組，另設(shè)1個(gè)陰性對(duì)照組，連續(xù)觀察30 d。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)

由表1可見(jiàn)，經(jīng)口給予小鼠不同劑量的受試物后，水對(duì)照組和3個(gè)劑量組共4個(gè)組的脾臟體重比值和胸腺體重比值的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間差異不顯著（P＞0.05），即受試物對(duì)小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值均無(wú)影響。水對(duì)照組和3個(gè)劑量組共4個(gè)組的小鼠足跖腫脹度的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間差異顯著（P＜0.05），用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其足跖腫脹度在對(duì)照組和低劑量組間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在對(duì)照組與中、高劑量組間比較有顯著性差異（P＜0.05），可以認(rèn)為受試物有提高小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的能力。

2.2 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和NK細(xì)胞活性

由表2可見(jiàn)，水對(duì)照組和3個(gè)劑量組共4個(gè)組的NK細(xì)胞活性和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組均數(shù)間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），因此，尚不能認(rèn)為受試物有提高小鼠淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞活性的能力。

2.3 體液免疫功能

由表3可見(jiàn)，水對(duì)照組和3個(gè)劑量組共4組的方差分析結(jié)果顯示，溶血空斑各組均數(shù)間比較差異有顯著性（P＜0.05），其抗體生成細(xì)胞數(shù)在對(duì)照組和低劑量組間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在對(duì)照組與中、高劑量組間比較有顯著性差異（P＜0.05），可以認(rèn)為受試物有提高小鼠抗體生成細(xì)胞數(shù)的能力；水對(duì)照組和3個(gè)劑量組共4個(gè)組的抗體積數(shù)的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），尚不能認(rèn)為受試物有提高小鼠血清溶血素水平的能力。

2.4 單核-巨噬細(xì)胞功能測(cè)定

由表4可見(jiàn)，水對(duì)照組和3個(gè)劑量組共4個(gè)組的碳廓清實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)的方差分析結(jié)果顯示，各組均數(shù)比較有顯著性差異（P＜0.05），對(duì)多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)進(jìn)行兩兩比較并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其吞噬指數(shù)在對(duì)照組和低、中劑量組間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在對(duì)照組和高劑量組間比較有顯著性差異（P＜0.05），可以認(rèn)為受試物高劑量組可增加小鼠單核-巨噬細(xì)胞的碳廓清能力。吞噬實(shí)驗(yàn)吞噬指數(shù)的方差分析結(jié)果顯示，吞噬指數(shù)各組均數(shù)間差異不顯著（P＞0.05），尚不能認(rèn)為受試物具有促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬能力。

表1 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）

表2 NK細(xì)胞活性和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）

表3 溶血空斑和溶血素實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）

表4 碳廓清實(shí)驗(yàn)與吞噬實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）

2.5 毒理試驗(yàn)

2.5.1 小鼠急性毒性試驗(yàn)

小鼠急性毒性試驗(yàn)見(jiàn)表5。實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)明顯中毒癥狀，且各組均未見(jiàn)死亡情況。最大耐受量法試驗(yàn)結(jié)果顯示，該受試物對(duì)兩種性別小鼠的最大耐受劑量MTD均大于20.0 g/kg.BW。根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該受試物屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)。

表5 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)期間，大鼠的活動(dòng)、攝食、飲水和排便等一般狀況均正常，無(wú)明顯中毒癥狀及死亡情況；各受試物劑量組的體重、進(jìn)食量、食物利用率、血常規(guī)、血液生化指標(biāo)以及肝/體比、腎/體比、脾/體比指標(biāo)與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此表明，該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陰性。

3 結(jié)論

富硒酵母、破壁靈芝孢子粉二者組方配伍，對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)不良影響，對(duì)小鼠脾臟體重比值和胸腺體重比值無(wú)影響，體液免疫、細(xì)胞免疫功能測(cè)定結(jié)果均為陽(yáng)性，單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能、NK細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果為陰性，且毒理試驗(yàn)證明本品安全無(wú)毒。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）對(duì)增強(qiáng)免疫保健食品的判斷標(biāo)準(zhǔn)，其可以增強(qiáng)小鼠免疫功能，具有調(diào)節(jié)免疫力功能。