徐有斌，章海紅

（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，浙江臺州 318000）

泰樂菌素是從弗氏鏈霉菌（Streptomyces fradiae）的培養(yǎng)液中獲得的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對多種革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用，還對部分革蘭氏陰性菌、彎桿菌、螺旋體有抑制作用，并具有抗球蟲作用，已被廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)的畜禽疾病防治或作為促生長的飼料添加劑。

泰樂菌素由微生物發(fā)酵培養(yǎng)獲得，在泰樂菌素發(fā)酵代謝過程中，產(chǎn)生的尾氣中包含大量CO2及剩余的O2，通過質(zhì)譜儀在線檢測尾氣中的CO2及O2，再經(jīng)過計算獲得發(fā)酵過程中的CO2釋放速率（CER）、攝氧率（OUR）及呼吸熵（RQ）等呼吸代謝參數(shù)，可以很直觀地反應(yīng)菌體代謝的狀況，在發(fā)酵種子移種條件、發(fā)酵過程狀態(tài)識別、優(yōu)化供氧水平、產(chǎn)率預(yù)測以及優(yōu)化發(fā)酵工藝等方面都有一定的指導(dǎo)意義，并在生產(chǎn)應(yīng)用中取得了良好的效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料

菌種為自有菌種，弗氏鏈霉菌。

1.2 主要設(shè)備

PrimaδB質(zhì)譜儀，美國Thermo ONIX公司；24 m3種子罐和150 m3發(fā)酵罐，發(fā)酵罐配置在線pH及溶解氧（DO）均為梅特勒特利多公司生產(chǎn)；1260液相色譜儀，美國AGILENT。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)溫度32 ℃，培養(yǎng)結(jié)束后，按8%～15%移種量接入發(fā)酵罐進行培養(yǎng)，溫度30 ℃培養(yǎng)，控制pH約7.0。

1.4 分析測試方法

效價采用HPLC測定，取發(fā)酵液樣品至100 mL容量瓶中，用純化水稀釋至刻度，搖勻，過濾。檢測條件為：波長280 nm；色譜柱C18，4.6 mm×200 mm，5 μm或者相當；流動相為2 mol/L高氯酸鈉∶乙腈=60∶40。

菌濃采用濕重法測定，10 mL發(fā)酵液在3 000 r/min條件下離心15 min；DO在移種后標定相對飽和度為95%；CER、OUR和RQ分別根據(jù)公式（1）～（3）計算，并均由計算機自動生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵種子移種條件

泰樂菌素發(fā)酵種子階段，處于發(fā)酵的早期生長階段，其中一個重要的生長指標為CO2的產(chǎn)生，通過分析尾氣中的CO2含量，并結(jié)合pH、DO的變化趨勢，可以很好地了解種子的生長狀態(tài)，量化移種條件，便于操作人員進行操作。

圖1為泰樂菌素種子生長階段典型的趨勢。由圖可以看出生長過程中，pH與CER趨勢具有明顯的特征對應(yīng)關(guān)系。種子培養(yǎng)前期，培養(yǎng)基中的淀粉類碳源會水解成葡萄糖，而葡萄糖作為碳源被菌體有氧呼吸利用并產(chǎn)生各種酸性物質(zhì)，如丙酮酸及三羧酸（TCA）循環(huán)中各種中間代謝物。隨著葡萄糖利用速度的逐漸增大，呼吸強度也相應(yīng)上升，但因處于培養(yǎng)適應(yīng)期，菌絲量較少，pH下降趨勢不明顯。中期，隨著培養(yǎng)基中部分氮源氨基酸脫氨基后直接參與到菌絲生長代謝，此階段會伴隨NH4+的釋放，從而導(dǎo)致pH上升并產(chǎn)生CO2。且由于菌絲大量產(chǎn)生，CER也明顯升高。后期，CER變化趨勢也同步pH的變化趨勢，表現(xiàn)出一定的對應(yīng)關(guān)系。

通常在大規(guī)模生產(chǎn)過程中，為了避免染菌，往往在種子培養(yǎng)階段盡量減少發(fā)酵罐的各種死角。而通過利用發(fā)酵尾氣檢測，泰樂菌素種子階段的生長趨勢也能進行在線識別，是一種對發(fā)酵移種時機的把握更具數(shù)據(jù)化的手段。

圖1 種子代謝趨勢

2.2 發(fā)酵過程狀態(tài)識別

泰樂菌素發(fā)酵具有典型的微生物發(fā)酵規(guī)律性，分為遲滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期及衰亡期。以往一般通過發(fā)酵過程的DO/pH等趨勢，結(jié)合鏡檢、菌絲濃度的檢測進行判別，但是由于離線檢測的時效性及精度，過程識別較為困難。在泰樂菌素發(fā)酵過程中，過程判斷并進行控制的好壞，對發(fā)酵影響較大，通過引入尾氣分析，對其中的CER、OUR及RQ進行分析，可以很好地區(qū)分發(fā)酵過程中的各個狀態(tài)。

圖2為泰樂菌素發(fā)酵較為典型的趨勢，圖3為泰樂菌素發(fā)酵代謝尾氣分析趨勢。結(jié)合圖2及圖3分析可以看到，發(fā)酵前期因菌絲利用淀粉類碳源分解成葡萄糖，進而進行有氧呼吸，產(chǎn)生各種有機酸，導(dǎo)致pH快速下降；泰樂菌素發(fā)酵前期生產(chǎn)速度很快，遲滯期時間相當短暫。之后隨著菌體量大量繁殖，菌體利用酸性物質(zhì)的速率加大，培養(yǎng)基中酸性物質(zhì)的濃度逐漸降低，pH開始反彈。當pH反彈到一定程度時，淀粉類碳源的水解速度已與菌體對葡萄糖的需求有相當大的差距，為滿足菌體生長的需要，菌體開始利用其他可利用的碳源，如有機氮源中谷氨酸（Glu）和丙氨酸（Ala）的氨基部分可用作氮源，而脫氨基后形成的酮酸部分可被菌體利用作為碳源，與此同時還會釋放一定堿性物質(zhì)NH4+，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中的pH上升，從圖3也可以看出此階段RQ值有所上升。之后發(fā)酵液中可被菌體快速利用的有機氮源的量也是有限的，所以當pH上升到一定幅度后又緩慢下降，同時CER增長的趨勢下降。所以泰樂菌素發(fā)酵尾氣數(shù)據(jù)與pH的相關(guān)性，反映了基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的淀粉類水解速率與菌體對葡萄糖的利用速率之間與菌體利用不同的碳源導(dǎo)致的動態(tài)平衡。此階段，尾氣數(shù)據(jù)快速變動，同時也表明了菌絲的生長階段進入快速生長期。當發(fā)酵進入40 h后，菌絲的呼吸強度（如CER及OUR）又開始逐步上升，且RQ值逐漸下降至0.7～0.8，此數(shù)值作為典型的菌體利用豆油的RQ值，基本上表明豆油已作為泰樂菌素發(fā)酵的唯一碳源，此階段開始泰樂菌素效價快速增長，進入產(chǎn)素期。

從尾氣數(shù)據(jù)看，中后期OUR及CER同比例有所下降，呼吸強度降低，表明菌絲過早進入衰亡期，具體表現(xiàn)在效價的增幅放緩。綜合pH、DO以及OUR、CER、RQ的變化趨勢，發(fā)酵操作人員很容易對泰樂菌素發(fā)酵的各個階段進行很好的識別，從而指導(dǎo)各個階段的精確控制以及發(fā)酵終點的判斷。

2.3 優(yōu)化供氧水平

泰樂菌素發(fā)酵采用豆油作為碳源，且作為典型的有氧發(fā)酵，在生產(chǎn)過程中，需要良好的供氧水平才能保障發(fā)酵的正常進行。為確保泰樂菌素發(fā)酵過程獲得適當?shù)娜苎酰杩刂铺肪匕l(fā)酵過程的DO在臨界氧濃度左右，避免因DO不足導(dǎo)致的代謝異?；蛘逥O過高引起的能源浪費以及可能對菌絲造成的傷害。

根據(jù)圖4中DO與尾氣OUR數(shù)據(jù)的對應(yīng)關(guān)系，可以很直觀地確定臨界氧濃度，因發(fā)酵段時間內(nèi)的參數(shù)相對穩(wěn)定，氧傳遞系數(shù)（KLa）也大致穩(wěn)定。隨著OUR升高，DO呈下降趨勢；反之，OUR降低，則DO開始上升。當DO降低至臨界氧濃度以下，則出現(xiàn)OUR變化趨勢與DO一致的情況，即同時上升或下降。

2.4 產(chǎn)率預(yù)測

泰樂菌素發(fā)酵產(chǎn)素期間，主要碳源來源于豆油，OUR的變化趨勢與效價增長有一定的關(guān)聯(lián)性，從圖3分析，OUR在發(fā)酵中后期下降，后期的效價增長幅度也變小，基于以上分析，在泰樂菌素發(fā)酵過程中，可以通過查看OUR的變化趨勢，來獲得產(chǎn)率的變化預(yù)測，從而及時提醒技術(shù)人員采取應(yīng)對措施。

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化

圖3 泰樂菌素發(fā)酵代謝尾氣分析趨勢

基于對OUR變化趨勢與效價增長方面的關(guān)聯(lián)性，為獲得后期更好的效價增長，對發(fā)酵中后期的OUR進行干預(yù)。分析認為，發(fā)酵中后期氮源的不足會引起豆油代謝的減弱，因此在發(fā)酵培養(yǎng)基中增加適量的氮源，可以避免中后期OUR的下降。在試驗過程中，將發(fā)酵培養(yǎng)基中的棉籽餅粉、魚粉及玉米蛋白粉的含量同時提高0.2%左右，培養(yǎng)參數(shù)相同的情況下，效價增長的趨勢如圖5所示。將氮源含量提高后，雖然中期OUR的絕對值低于未調(diào)整時，但中后期OUR保持穩(wěn)定并有一定的回升趨勢，表現(xiàn)在發(fā)酵中后期效價的增長趨勢未下降，相較于調(diào)整前，發(fā)酵罐效價提高了14.8%。在大規(guī)模生產(chǎn)中，泰樂菌素發(fā)酵代謝經(jīng)常受原材料影響產(chǎn)生波動，通過監(jiān)測尾氣參數(shù)及時調(diào)整工藝控制，對穩(wěn)定發(fā)酵生產(chǎn)水平有較大幫助。

圖4 泰樂菌素發(fā)酵OUR與DO趨勢

圖5 改良前后泰樂菌素OUR與效價增長趨

2.6 其他方面的應(yīng)用

尾氣分析在發(fā)酵中還有其他方面的應(yīng)用，如發(fā)酵染菌會引起OUR、CER 的異常變化，且根據(jù)染菌的種類，其OUR、CER 的趨勢也不相同，掌握其染菌的種類與相應(yīng)的尾氣變化趨勢，可以初步判斷染菌的種類。

3 結(jié)論

通過分析泰樂菌素發(fā)酵中尾氣參數(shù)的變化，結(jié)合發(fā)酵過程中常規(guī)的在線DO、pH等監(jiān)測值，對泰樂菌素發(fā)酵種子移種條件判斷、發(fā)酵狀態(tài)識別、優(yōu)化供氧水平、產(chǎn)率預(yù)測、工藝優(yōu)化等方面起到很好的指導(dǎo)作用。且尾氣在線監(jiān)測取樣點位于排氣管，不影響發(fā)酵罐結(jié)構(gòu)，不直接接觸發(fā)酵液，無發(fā)酵染菌影響。相信在泰樂菌素或其他產(chǎn)品的發(fā)酵生產(chǎn)中引入尾氣分析可以推動發(fā)酵技術(shù)水平的進步。