*陳東 張曉強(qiáng) 納奇 鎖嘉偉
(寧夏泰益欣生物科技有限公司 寧夏 750205)
泰樂菌素(Tylosin),亦稱泰農(nóng)、泰樂霉素,是美國于1959年從弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的培養(yǎng)液中獲得的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。泰樂菌素的外觀呈現(xiàn)為一種白色板狀結(jié)晶,在水中的溶解性較低,呈現(xiàn)堿性。主要的產(chǎn)品有酒石酸泰樂菌素、磷酸泰樂菌素、鹽酸泰樂菌素、硫酸泰樂菌素及乳酸泰樂菌素,以上鹽在水中的溶解性良好。泰樂菌素水溶液在25℃、pH5.5~7.5時可保存3個月,但是當(dāng)水溶液中含有鐵離子、銅離子等金屬離子時,會使泰樂菌素水溶液失效。
泰樂菌素是禽畜專用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,其活性組分主要包括ABCD四種,以A組分為主,在動物體內(nèi)的活性最強(qiáng)[1]。在2011版英國藥典(獸藥)中,規(guī)定泰樂菌素的總組分(A+B+C+D)含量在95%以上,且A組分含量在80%以上[2]。目前,已有報道顯示泰樂菌素對于禽畜類的多種病癥均具有較好的預(yù)防和治療效果。與此同時,其作為飼料添加劑已經(jīng)被國際所認(rèn)可,且在國內(nèi)甚至國際市場上的需求量都較大[3]。純度較高的泰樂菌素成品具有廣闊的市場前景,也能帶來較為良好的經(jīng)濟(jì)效益。隨之而來的問題就是,如何獲得純度較高的泰樂菌素,這也成為了目前的研究方向和發(fā)展趨勢。
在生物制藥行業(yè)中,萃取的方法被廣泛應(yīng)用,此種方法可以有效去除泰樂菌素中大部分水溶性雜質(zhì)及無機(jī)鹽,將泰樂菌素的有效成分從水相轉(zhuǎn)移至有機(jī)相,除去水溶性雜質(zhì),然后通過二級反萃取的方式將泰樂菌素分階段的從有機(jī)相轉(zhuǎn)移至水相,再經(jīng)過中和精制,得到高純度的泰樂菌素。達(dá)到降低雜質(zhì)含量,提升泰樂菌素純度的目的。
圖1 泰樂菌素結(jié)構(gòu)式
實驗中所需數(shù)顯式恒溫磁力攪拌水浴鍋由天津華鑫儀器提供;低溫恒溫循環(huán)水浴槽由中儀科瑞(鄭州)設(shè)備有限公司提供;酸度計由梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司提供;高效液相色譜儀由安捷倫科技公司提供;分析天平由上海良平儀器儀表有限公司提供。
實驗中所需氫氧化鈉、酒石酸、乙酸丁酯全部由天津市承大化學(xué)試劑有限公司提供;氫氧化鈣、甲醇、乙腈全部由天津市大茂化學(xué)試劑有限公司提供。
泰樂菌素濾液來源于寧夏泰益欣生物科技股份有限公司。
①實驗方法
取泰樂菌素濾液以及套用乙酸丁酯,分別設(shè)置濾液:乙酸丁酯=1:1.5;1:1;1:0.8;1:0.4四種比例進(jìn)行混合,置于數(shù)顯恒溫水浴鍋內(nèi),分別設(shè)置30℃、35℃、40℃、45℃、50℃五個萃取溫度。設(shè)定萃取時間分別為20min、25min、30min、35min;分別設(shè)置萃取次數(shù)為一次萃取,兩次萃取,三次萃??;使用濃度為10%~15% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH,最終pH調(diào)節(jié)到9.0~9.4左右;然后再進(jìn)行反萃取,最后進(jìn)行中和精制工藝得到精制液、取樣、待檢。
②檢測方法
用高效液相色譜儀進(jìn)行含量檢測,檢測方法按照泰樂菌素組分檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(USP)進(jìn)行。
色譜條件:以十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑;以200g/L高氯酸鈉溶液-乙腈(60:40)為流動相;檢測波長設(shè)定為290nm;色譜柱型號為:4.6mm×25cm,粒徑5um;流速設(shè)定為1.0ml/min;柱箱溫度設(shè)定為35℃。
流動相具體配制方法為:200g/L高氯酸鈉溶液與乙腈按照體積比為60:40進(jìn)行配制,混合均勻之后進(jìn)行過濾,用超聲波清洗器除去流動相中的氣泡,即得。
供試品溶液配制方法為:準(zhǔn)確稱取供試品20mg,置100ml容量瓶中,加入乙腈-水(1:1)進(jìn)行溶解并稀釋,準(zhǔn)確定容至刻度線,搖勻,即得。
對照品溶液配制方法為:稱取泰樂菌素對照品(USP)20mg,精密稱定,置100ml容量瓶中,加乙腈-水(1:1)進(jìn)行溶解并稀釋,準(zhǔn)確定容至刻度線,搖勻,即得。
在萃取這一工序中,萃取劑的用量對萃取的效果會產(chǎn)生極大地作用。萃取劑使用過量可能會加大試劑的浪費(fèi),導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高;而萃取劑使用量減少會導(dǎo)致萃取不徹底,從而造成泰樂菌素的損失。因此本實驗設(shè)置四種投料比例進(jìn)行驗證,分別為1:0.4,1:0.8;1:1;1:1.5;其余條件固定不變,考察對泰樂菌素A組分含量的影響。具體結(jié)果由表1所示。
表1 加量比例對泰樂菌素A組分含量的影響
由表1和圖2可知,隨著投料比例的改變,泰樂菌素A組分含量為一個先增加后降低的改變趨勢,當(dāng)加量比例設(shè)置為1:0.8時,得到的泰樂菌素A組分含量為最高。
圖2 加量比例對泰樂菌素A組分含量的影響
一般來說,隨著溫度的升高,溶質(zhì)在水相及萃取劑中的溶解度都會有所提高,而且在萃取劑中的溶解度比在溶質(zhì)中的溶解度大,所以利于萃取的進(jìn)行。除此之外,溫度升高,溶液的黏度降低,也便于萃取劑與水的分離。但是當(dāng)溫度過高時,就會導(dǎo)致萃取劑的損失增多。因此設(shè)置不同萃取溫度進(jìn)行驗證,分別為30℃、35℃、40℃、45℃、50℃,保持其余條件不變,考察對泰樂菌素A組分含量的影響。具體結(jié)果由表2所示。
表2 萃取溫度對泰樂菌素A組分含量的影響
由表2和圖3可知,隨著萃取溫度的逐漸增加時,泰樂菌素A組分含量變化為先增加后降低,當(dāng)萃取溫度為45℃時,泰樂菌素A組分的含量達(dá)到最佳。此后再升高溫度時泰樂菌素A組分含量開始降低,綜合來看,當(dāng)萃取溫度為45℃時,泰樂菌素A組分含量最佳。
圖3 萃取溫度對泰樂菌素A組分含量的影響
萃取是提純的手段之一,而萃取次數(shù)也至關(guān)重要。單次萃取效率遠(yuǎn)低于多次萃取,而隨著萃取次數(shù)的增加,濾液中泰樂菌素的有效成分會逐漸降低,此時繼續(xù)增加萃取次數(shù),泰樂菌素A含量降低,還會造成萃取劑的浪費(fèi),導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。因此設(shè)置不同萃取次數(shù)進(jìn)行驗證,分別為一次萃取、兩次萃取、三次萃取,保持其余條件不變,考察對泰樂菌素A組分含量的影響。具體結(jié)果由表3所示。
表3 萃取次數(shù)對泰樂菌素A組分含量的影響
由表3和圖4可知,當(dāng)萃取次數(shù)的逐漸增加時,泰樂菌素A組分含量逐漸降低,萃取次數(shù)越多,泰樂菌素A組分含量越低,但一次萃取顯然無法將絕大多數(shù)有效成分萃取出來,綜合生產(chǎn)成本與萃取效率,當(dāng)萃取次數(shù)為兩次時,既能盡可能多的將泰樂菌素A組分萃取完全,又能節(jié)約成本,因此確定萃取次數(shù)為兩次。
圖4 萃取次數(shù)對泰樂菌素A組分含量的影響
在進(jìn)行萃取工序時,萃取時間的長短對萃取效率的影響也極為重要。萃取時間過短,會導(dǎo)致泰樂菌素有效成分萃取不完全,從而導(dǎo)致泰樂菌素A組分降低;而當(dāng)萃取時間過長時,不僅對萃取效率起不到明顯的促進(jìn)作用,反而會造成預(yù)料之外的浪費(fèi)。因此設(shè)置20min、25min、30min、35min、40min等不同萃取時間,保持其它條件不改變,考察對泰樂菌素A組分含量的影響。具體結(jié)果由表4所示。
表4 萃取時間對泰樂菌素A組分含量的影響
由表4可知,隨著萃取時間的延長,泰樂菌素A組分含量增加,當(dāng)萃取時間在25~30min這一范圍內(nèi)時,泰樂菌素A組分含量基本保持不變且為最佳,而后萃取時間繼續(xù)增加,泰樂菌素A組分含量變化不大,綜合生產(chǎn)時間來看,當(dāng)萃取時間為25~30min時,所得泰樂菌素A組分含量是最高的。
通過單因素試驗,獲得最優(yōu)參數(shù),組合成為最優(yōu)的泰樂菌素萃取工藝條件,具體參數(shù)如下:泰樂菌素濾液加量:乙酸丁酯加量=1:0.8、萃取溫度為45℃、進(jìn)行兩次萃取、萃取時間控制為25~30min。以此組合工藝條件進(jìn)行3組平行實驗驗證此工藝條件的穩(wěn)定性,結(jié)果如表5所示。
表5 平行實驗驗證數(shù)據(jù)
由表5可知,三組實驗中所得到的泰樂菌素A組分平均含量為89.6%。
本研究通過對泰樂菌素濾液與乙酸丁酯投料比例、萃取溫度、萃取次數(shù)、萃取時間等工藝參數(shù)分別進(jìn)行單因素實驗,結(jié)果表明:當(dāng)投料比例為1:0.8、萃取溫度為45℃、萃取次數(shù)為兩次萃取、萃取時間控制為25~30min時實驗結(jié)果最優(yōu),并驗證最優(yōu)參數(shù)組合工藝對泰樂菌素的萃取具有顯著的影響,為泰樂菌素的A組分含量的提升提供了有力的支撐,依據(jù)此工藝可繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化實驗。