陳東，郭佳，王婷，白海龍，哈麗媛

(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

泰樂菌素(Tylosin)，又稱泰樂星、泰樂霉素，一種禽畜專用的由弗氏鏈霉菌產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類抗生素[1-2]。泰樂菌素不僅是我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)防治支原體疾病的理想藥劑，而且是一種優(yōu)良的飼料添加劑，除疾病預防外，對禽、畜生長也有良好的促進作用。

在菌種發(fā)酵過程中，補料量、pH值、溶解氧濃度、溫度、底物濃度、產(chǎn)物濃度等對微生物的生長起重要作用[3-4]。泰樂菌素在發(fā)酵后期由于菌體易老化和自溶，導致生產(chǎn)能力下降，嚴重影響泰樂菌素產(chǎn)量[5]。當前，國內(nèi)泰樂菌素生產(chǎn)工藝普遍采用分批補料的方式，通過控制和優(yōu)化補料量等參數(shù)的變化，使發(fā)酵效價達到最大[6]。然而，現(xiàn)有工業(yè)生產(chǎn)中對泰樂菌素發(fā)酵補料時間及補料次數(shù)的研究鮮有報道。因此，本研究以泰樂菌素分批補料發(fā)酵工藝為基礎，對泰樂菌素發(fā)酵補料工藝進行優(yōu)化研究，探討泰樂菌素發(fā)酵的最佳補料時間和補料次數(shù)。

1 儀器與試劑

1.1 試劑

豆油、硫酸銨；綜合補料培養(yǎng)基成分組成：玉米淀粉為0.5%、(NH4)2HPO4為 0.2%、麩質(zhì)粉為1.0%、CaCO3為0.8%、棉籽餅粉為1.5%、硫酸鎳為0.2%、NaCl為0.5%、KCl為0.1%、CoCl2為 0.8%、純化水(其余)。

1.2 儀器

實驗儀器如表1所示。

表1 實驗儀器

2 材料與方法

2.1 實驗材料

泰樂菌素菌種由寧夏泰益欣生物科技股份有限公司提供。

2.2 實驗方法

泰樂菌素效價采用高效液相色譜法(HPLC)檢測：發(fā)酵液殘?zhí)遣捎梅屏衷噭┓z測；采用甲醛氧化法檢測發(fā)酵液中氨基氮含量。

2.3 數(shù)據(jù)處理

所得試驗數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理分析。

3 結果與分析

3.1 補油對泰樂菌素效價的影響

豆油含有豐富的油酸和亞油酸，二者經(jīng)過甲基化生成甲基油酸，其作為泰樂菌素的前體物質(zhì)，能促進泰樂菌素的生物合成，因此工業(yè)生產(chǎn)中常以豆油作為泰樂菌素發(fā)酵的主要碳源[7]。相關研究證明，豆油濃度影響泰樂菌素的產(chǎn)量，其含量過低，不利于泰樂菌素菌絲生長，而含量過高不易充分利用，造成脂肪酸過量，降低發(fā)酵液pH值，影響菌種產(chǎn)素能力，降低泰樂菌素產(chǎn)量[8]。因此，泰樂菌素菌種發(fā)酵過程中，嚴格控制豆油的加量對其發(fā)酵起至關重要的作用。

接種8 h后，每隔4 h檢測發(fā)酵液pH值，當pH值小于6.6時，以0.2%進料量補加豆油，維持泰樂菌素發(fā)酵液pH值處于7.0～7.2之間。接種48 h后，每隔24 h進行泰樂菌素發(fā)酵液效價測定，觀察補加豆油后泰樂菌素發(fā)酵液效價變化趨勢。圖1結果表明：補加豆油后泰樂菌素發(fā)酵液效價增速顯著提高，在發(fā)酵后期高達14 100 μg/mL，較無補油增高了19.90%。原因可能是及時補加豆油不僅為泰樂菌素發(fā)酵提供碳源，而且其脂肪酸分解后通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值，使之處于菌體產(chǎn)素的最佳范圍，從而提升了泰樂菌素發(fā)酵效價。

圖1 補油對泰樂菌素效價的影響

3.2 補加硫酸銨對泰樂菌素效價的影響

接種8 h后，每4 h檢測1次氨基氮含量，根據(jù)氨基氮含量補加硫酸銨，流速為0.15%/d，接種48 h后，每隔24 h進行泰樂菌素發(fā)酵液效價測定，觀察補加硫酸銨后泰樂菌素發(fā)酵液效價變化情況。泰樂菌素氨基氮檢測結果如圖2所示，泰樂菌素發(fā)酵效價變化情況如圖3所示。

圖2 泰樂菌素氨基氮檢測結果

圖3 補加硫酸銨對泰樂菌素效價的影響

根據(jù)發(fā)酵液中的氨基氮含量優(yōu)化補料工藝，以期提升泰樂菌素發(fā)酵效價。補加硫酸銨使氨基氮水平維持在50～90 mg/mL之間。由圖3可知，隨著發(fā)酵周期的延長，補加硫酸銨后泰樂菌素發(fā)酵效價增速明顯提升，且在發(fā)酵后期高達13 900 μg/mL，較無補料效價提高了25.68%。

3.3 單次補料時間對泰樂菌素發(fā)酵效價的影響

基于豆油和硫酸銨的補料發(fā)酵情況及發(fā)酵液中的殘?zhí)呛窟M行單次補料實驗，分別于發(fā)酵48、72、96、120、144 h后進行單次補料，研究單次補料時間對泰樂菌素發(fā)酵效價的影響。泰樂菌素殘?zhí)菨舛葯z測結果如圖4所示，泰樂菌素效價變化情況如圖5所示。

圖4 泰樂菌素殘?zhí)菨舛葯z測結果

圖5 單次補料對泰樂菌素發(fā)酵效價的影響

由圖4可知，補料使泰樂菌素殘?zhí)菨舛染S持在0.50～2.00 g/100 mL之間。由圖5可知：單次補料發(fā)酵效價顯著高于無補料發(fā)酵效價，其中在48 h補料時效果最佳，發(fā)酵液效價增速穩(wěn)定，發(fā)酵后期效價高達13 987 μg/mL，顯著高于其他補料批次；96 h補料次之，其發(fā)酵效價增速相對穩(wěn)定，但效價低于48 h補料發(fā)酵效價；72 h補料對泰樂菌素發(fā)酵效價增速促進不大，在發(fā)酵后期，增速減弱；120 h和144 h補料對泰樂菌素發(fā)酵效價促進作用較小，最終發(fā)酵效價顯著低于其他實驗批次。

3.4 兩次補料對泰樂菌素發(fā)酵效價的影響

在單次補料實驗基礎上，嘗試在發(fā)酵48 h補料后分別在72 h、96 h、120 h、144 h 進行第2次補料，每隔24 h測定發(fā)酵液效價，研究兩次補料對泰樂菌素發(fā)酵效價的影響，如圖6所示。

圖6 2次補料對泰樂菌素發(fā)酵效價的影響

由圖6可知，兩次補料顯著提升了泰樂菌素發(fā)酵效價，尤其在發(fā)酵96 h進行第2次補料時，其發(fā)酵效價顯著高于其他實驗批次，達到14 500 μg/mL，效價增速穩(wěn)定；其次是發(fā)酵72 h進行第2次補料，最終效價為13 100 μg/mL，較96 h補料發(fā)酵效價降低了10.69%；120 h進行第2次補料后泰樂菌素發(fā)酵效價增速緩慢；144 h 進行第2次補料最終發(fā)酵效價顯著低于其他實驗批次發(fā)酵效價。

4 討論

無補料發(fā)酵工藝因發(fā)酵前期發(fā)酵液營養(yǎng)豐富，菌體快速生長，后期缺乏菌體必需營養(yǎng)素而造成早衰，影響菌體產(chǎn)素能力。相關研究證明，菌種發(fā)酵過程中，優(yōu)化補料量不僅能降低能源消耗與經(jīng)濟成本，更能提高菌種發(fā)酵效率[9-10]。因此，基于豆油和硫酸銨的補料發(fā)酵情況及發(fā)酵液中的殘?zhí)呛亢桶被績?yōu)化泰樂菌素補料工藝，通過對補料次數(shù)和補料時間進行研究發(fā)現(xiàn)，兩次補料發(fā)酵效價提升效率更高，其最終效價較單次補料發(fā)酵效價提高了3.67%，且最優(yōu)補料時間分別是在發(fā)酵48 h和96 h，發(fā)酵效價從13 987 μg/mL提高至14 500 μg/mL。原因可能是發(fā)酵初期，泰樂菌素新生菌絲較多，但在中后期，尤其是在后期菌體出現(xiàn)自溶，菌絲減少進而影響菌體產(chǎn)素能力，而后期補料能及時提供菌體所需營養(yǎng)，延緩菌體早衰、促進新生菌絲的形成，從而提升泰樂菌素的發(fā)酵效價。基于本研究，推測多次補料可為泰樂菌素菌種提供更均衡的營養(yǎng)物質(zhì)，提高菌種產(chǎn)素能力，對發(fā)酵效能及產(chǎn)量提升效率更高，擬在下一步實驗中進行泰樂菌素多次補料研究，以期獲得更高的發(fā)酵效價，提高泰樂菌素產(chǎn)量。