鮮雪梅，畢穎超，王珍珍，門燕娟，常佳佳，陳全剛，韓旭峰，鄭葵陽(yáng)，陳仁金

（1.徐州醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2.徐州醫(yī)科大學(xué) 腫瘤生物治療研究所，江蘇 徐州 221006；3.徐州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江蘇 徐州 221000）

動(dòng)脈粥樣硬化是一種對(duì)危害人類健康的慢性炎癥性疾病，也是引起老年人死亡的最普遍的原因之一[1]。其特征在于動(dòng)脈斑塊中膽固醇充盈巨噬細(xì)胞的持續(xù)存在[2-6]。巨噬細(xì)胞是斑塊中最豐富的炎癥細(xì)胞類型。在病變中，巨噬細(xì)胞感知來(lái)自其微環(huán)境的信號(hào)（例如細(xì)胞因子或修飾的脂蛋白）發(fā)生表型極化[7-9]，這是一個(gè)隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，通過(guò)改變自身表型，根據(jù)環(huán)境信號(hào)產(chǎn)生促炎和抗炎作用[10]。真核起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E）在蛋白正常合成的起始階段起重要的調(diào)控作用[11-13]，在正常情況下低表達(dá)，而在多種癌癥中發(fā)生變化[14]。其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、癌癥及神經(jīng)生物學(xué)有巨大影響[15]。eIF4E 翻譯效率的選擇性變化直接導(dǎo)致巨噬細(xì)胞分化和活化[16-17]。目前，eIF4E 的表達(dá)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化中的影響很少報(bào)道。本文采用分子生物學(xué)及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)eIF4E 在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)，以探討其在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的炎癥調(diào)節(jié)作用，為治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 ～8 周遺傳背景相同的雄性載脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠（購(gòu)自南京模式動(dòng)物中心）和C57BL/6J 小鼠（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）各18 只，飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF 要求。

1.2 試劑與儀器

RAW264.7 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，eIF4E 抗體（小鼠源）購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)（上海）有限公司，Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和TB GreenTMPremix Ex TaqTM購(gòu)自大連TaRaKa 公司，考馬斯亮藍(lán)試劑購(gòu)自江蘇凱基生物有限公司，CD206（兔源）、CD86（兔源）購(gòu)自Proteintech 公司（武漢），Alexa Fluor 488（抗鼠）、Alexa Fluor 594（抗兔）購(gòu)自徐州微科曼得生物工程有限公司。

倒置熒光顯微鏡IX73 購(gòu)自日本奧林巴斯公司，Leica 冷凍切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司，電泳儀和凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，Centrifuge 5804R 超低溫臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司，Light Cycler ?480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分組及處理RAW264.7 細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的無(wú)菌DMEM 培養(yǎng)基置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)傳代并更換新鮮DMEM 完全培養(yǎng)基。調(diào)整細(xì)胞密度并按每孔約1×106個(gè)細(xì)胞鋪于12 孔板中，待貼壁后，其中3 孔加入脂多糖（LPS）（終濃度為200 ng/ml），將細(xì)胞誘導(dǎo)成M1 型巨噬細(xì)胞，為L(zhǎng)PS 誘導(dǎo)組；3 孔加入白細(xì)胞介素-4（IL-4）（終濃度為20 ng/ml），將細(xì)胞誘導(dǎo)成M2 型巨噬細(xì)胞，為IL-4 誘導(dǎo)組；對(duì)照組不加藥。誘導(dǎo)12 h 后提取RNA。按照同樣的方法將細(xì)胞誘導(dǎo)24 h 后提取蛋白，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理將18 只ApoE-/-小鼠和18 只C57BL/6J 小鼠分成6 組，每組3 只ApoE-/-小鼠和3 只C57BL/6J 小鼠，其中C57BL/6J 小鼠為對(duì)照組。均喂食高脂飼料16 周后脫頸處死小鼠，心臟灌注5 ml 生理鹽水，將腹主動(dòng)脈取出后，在體視顯微鏡下將腹主動(dòng)脈外面的脂肪剝離干凈。其中3 組腹主動(dòng)脈用于提取蛋白，另外3 組腹主動(dòng)脈用于提取RNA，提取RNA 時(shí)不需要灌注，以免RNA 降解。同時(shí)取出ApoE-/-小鼠心臟竇部，用OCT 冷凍包埋劑包埋，置入-80℃冰箱冷凍保存，用于冷凍切片。

1.3.3 Western blotting 檢測(cè)eIF4E 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別檢測(cè)各組細(xì)胞和小鼠腹主動(dòng)脈中eIF4E 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。采用裂解液（含PMSF）裂解細(xì)胞和組織（組織需勻漿），吹打均勻置冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min 離心15 min，取蛋白上清液，考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度，剩余蛋白與上樣緩沖液按比例混勻，沸水浴5 min，置入-80℃冰箱冷凍保存。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中進(jìn)行蛋白分離，冰浴條件下轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，加入一抗，4℃搖床孵育過(guò)夜。PBST 洗滌4次，加入相應(yīng)的二抗，孵育1 h 后，PBST 洗4 次，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，成像系統(tǒng)拍照，用Image J 軟件進(jìn)行圖像分析。以目的條帶（eIF4E）與內(nèi)參（β-actin）條帶吸光面積積分的比值分析目的蛋白表達(dá)。在細(xì)胞水平檢測(cè)eIF4E 蛋白在M1 型、M2 型巨噬細(xì)胞和對(duì)照組中的表達(dá)；在動(dòng)物組織水平上檢測(cè)eIF4E 蛋白在ApoE-/-和對(duì)照組中的表達(dá)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)eIF4E mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別檢測(cè)各組細(xì)胞和各組動(dòng)物腹主動(dòng)脈中eIF4E mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。采用Trizol 法提取各組細(xì)胞和小鼠腹主動(dòng)脈的總RNA（組織需勻漿），使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用TB GreenTMPremix Ex TaqTM進(jìn)行qRT-PCR。eIF4E 引物：正向5'-AGGACGGTGGCTGATCACA-3'，反向5'-TCTCTAGCC AGAAGCGATCGA-3'；GAPDH 引物：正向5'-CAACTTT GGCATTGTGGAAGG-3'，反向5'-ACACATTGGGGGT AGGAACAC-3'。以GAPDH 為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次設(shè)3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在細(xì)胞水平檢測(cè)eIF4E mRNA 在M1 型、M2 型巨噬細(xì)胞和對(duì)照組中的表達(dá)；在動(dòng)物組織水平檢測(cè)eIF4E mRNA 在ApoE-/-和對(duì)照組中的表達(dá)。

1.3.5 組織免疫熒光檢測(cè)eIF4E 與M1 和M2 型巨噬細(xì)胞共定位表達(dá)將心臟竇部用冷凍切片機(jī)切6mm 厚，4%多聚甲醛固定15min，PBST 洗5min/次，洗3 次；0.25% Triton X-100 破膜5 min，5%封閉液室溫封閉1 h；孵育兔源一抗CD206/CD86（兔源，1∶100）和eIF4E（小鼠源，1 ∶300）混合液，4℃過(guò)夜；第2 天，先室溫平衡30 min，然后用PBST 洗5 min/次，洗3 次；室溫孵育熒光二抗488（山羊抗鼠，1 ∶100）和594（山羊抗兔，1∶100）混合液1 h，PBST洗5 min/次，洗3次；孵育DAPI 5 min，PBST 洗5 min/次，洗3 次；抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡觀察拍照。在組織上檢測(cè)eIF4E 在M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞中的共表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 eIF4E mRNA 和蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)

對(duì)照組、IL-4 誘導(dǎo)組和LPS 誘導(dǎo)組細(xì)胞中eIF4E mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（1.010±0.157）、（2.102±0.375）和（5.832±0.774），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.329，P=0.000），進(jìn)一步兩兩比較，LPS誘導(dǎo)組eIF4E mRNA 表達(dá)高于IL-4 誘導(dǎo)組（P＜0.05）。對(duì)照組、IL-4 誘導(dǎo)組和LPS 誘導(dǎo)組eIF4E 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.130±0.032）、（0.261±0.131）和（0.606±0.134），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.834，P=0.011），進(jìn)一步兩兩比較，LPS 誘導(dǎo)組eIF4E蛋白表達(dá)高于IL-4 誘導(dǎo)組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 eIF4E mRNA 和蛋白在組織中的表達(dá)

對(duì)照組和ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈中eIF4E mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（0.927±0.146）和（6.414±0.297），經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-33.174，P=0.000），ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈中eIF4E mRNA 表達(dá)高于對(duì)照組；對(duì)照組和ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈中eIF4E 蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.225±0.078）和（2.342±0.594），經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-6.122，P=0.004），ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈中eIF4E 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組。見(jiàn)圖2。

2.3 eIF4E 與M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞共表達(dá)

圖1 各組細(xì)胞中eIF4E mRNA 和蛋白的表達(dá)

ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部切片免疫熒光結(jié)果顯示eIF4E 與CD86 的共定位比eIF4E 與CD206 的共定位表達(dá)多，eIF4E 在M1 型巨噬細(xì)胞中的含量高于M2 型巨噬細(xì)胞。見(jiàn)圖3。

圖2 各組小鼠腹主動(dòng)脈中eIF4E mRNA 和蛋白的表達(dá)

圖3 eIF4E 與M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞共表達(dá) （免疫熒光×100）

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥，炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段都發(fā)揮重要作用。在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展和進(jìn)展期間，巨噬細(xì)胞暴露于許多環(huán)境信號(hào)[18]?；谄湓诎邏K內(nèi)的定位和分布，巨噬細(xì)胞展現(xiàn)不同的極化狀態(tài)和功能表型[19]。目前，治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物主要是降脂及抗凝等，但療效不理想，因此仍需從基因水平和細(xì)胞分子方面探索動(dòng)脈粥樣硬化新療法。

真核生物基因表達(dá)調(diào)控的一種機(jī)制是控制翻譯速率，翻譯調(diào)控在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。可以在翻譯的起始、伸長(zhǎng)和終止中的每一步控制翻譯速率[20]。在翻譯起始時(shí)，需要大量的真核翻譯起始因子的協(xié)作才能完成。其中異源三聚體復(fù)合物eIF4F 中的eIF4E 與mRNA 5'-端帽子結(jié)構(gòu)的結(jié)合是該階段的核心。已有研究表明，eIF4E 抑制性蛋白能夠通過(guò)雷帕霉素復(fù)合物1-eIF4E 結(jié)合蛋白1/2 軸協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄，從而編碼限制巨噬細(xì)胞中抗炎反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄程序。而eIF4E 通過(guò)與eIF4E 抑制性蛋白的結(jié)合而破壞翻譯的起始過(guò)程，抑制mRNA 翻譯。翻譯抑制已成為炎癥反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)機(jī)制[21-22]。

本研究用分別LPS 和IL-4 誘導(dǎo)細(xì)胞分化成M1型和M2 型巨噬細(xì)胞后檢測(cè)2 種細(xì)胞中eIF4E 蛋白和mRNA 的表達(dá)差異，結(jié)果表明eIF4E 蛋白和mRNA 在M1 型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)均高于M2 型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞通過(guò)促炎細(xì)胞因子等加速免疫細(xì)胞內(nèi)皮下招募和血管壁重塑，M2 型巨噬細(xì)胞通過(guò)抗炎細(xì)胞因子減緩動(dòng)脈粥樣硬化并使斑塊穩(wěn)定。初步說(shuō)明eIF4E主要通過(guò)M1 型巨噬細(xì)胞發(fā)揮促炎作用。在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，eIF4E 與CD86 的共定位表達(dá)比eIF4E 與CD206 的共定位表達(dá)多，且eIF4E 蛋白和mRNA 在ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈中表達(dá)也高于對(duì)照組。動(dòng)物組織實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步說(shuō)明eIF4E 在動(dòng)脈粥樣硬化疾病中起促炎調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，eIF4E 通過(guò)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化起到炎癥調(diào)控作用，其主要是通過(guò)調(diào)控M1 型巨噬細(xì)胞極化起到促炎調(diào)節(jié)作用。本研究?jī)H從ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型做初步研究，后續(xù)會(huì)通過(guò)對(duì)小鼠eIF4E 和ApoE 雙基因敲除后，進(jìn)一步探討其在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中的具體作用以及相關(guān)通路，以期為臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化提供一定的理論依據(jù)。