鮮雪梅,畢穎超,王珍珍,門燕娟,常佳佳,陳全剛,韓旭峰,鄭葵陽,陳仁金
(1.徐州醫(yī)科大學 生命科學學院,江蘇 徐州 221000;2.徐州醫(yī)科大學 腫瘤生物治療研究所,江蘇 徐州 221006;3.徐州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院,江蘇 徐州 221000)
動脈粥樣硬化是一種對危害人類健康的慢性炎癥性疾病,也是引起老年人死亡的最普遍的原因之一[1]。其特征在于動脈斑塊中膽固醇充盈巨噬細胞的持續(xù)存在[2-6]。巨噬細胞是斑塊中最豐富的炎癥細胞類型。在病變中,巨噬細胞感知來自其微環(huán)境的信號(例如細胞因子或修飾的脂蛋白)發(fā)生表型極化[7-9],這是一個隨時間變化的動態(tài)過程,通過改變自身表型,根據(jù)環(huán)境信號產(chǎn)生促炎和抗炎作用[10]。真核起始因子4E(eukaryotic initiation factor 4E, eIF4E)在蛋白正常合成的起始階段起重要的調(diào)控作用[11-13],在正常情況下低表達,而在多種癌癥中發(fā)生變化[14]。其對細胞的生長、發(fā)育、癌癥及神經(jīng)生物學有巨大影響[15]。eIF4E 翻譯效率的選擇性變化直接導致巨噬細胞分化和活化[16-17]。目前,eIF4E 的表達對動脈粥樣硬化中的影響很少報道。本文采用分子生物學及免疫組織化學法檢測eIF4E 在動脈粥樣硬化斑塊中的表達,以探討其在動脈粥樣硬化過程中的炎癥調(diào)節(jié)作用,為治療動脈粥樣硬化提供新思路。
6 ~8 周遺傳背景相同的雄性載脂蛋白E 基因敲除(ApoE-/-)小鼠(購自南京模式動物中心)和C57BL/6J 小鼠(購自北京維通利華實驗動物技術有限公司)各18 只,飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學實驗動物中心,飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF 要求。
RAW264.7 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心,eIF4E 抗體(小鼠源)購自圣克魯斯生物技術(上海)有限公司,Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和TB GreenTMPremix Ex TaqTM購自大連TaRaKa 公司,考馬斯亮藍試劑購自江蘇凱基生物有限公司,CD206(兔源)、CD86(兔源)購自Proteintech 公司(武漢),Alexa Fluor 488(抗鼠)、Alexa Fluor 594(抗兔)購自徐州微科曼得生物工程有限公司。
倒置熒光顯微鏡IX73 購自日本奧林巴斯公司,Leica 冷凍切片機購自德國徠卡公司,電泳儀和凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司,Centrifuge 5804R 超低溫臺式離心機購自德國Eppendorf 公司,Light Cycler ?480 Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR 儀購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。
1.3.1 細胞分組及處理RAW264.7 細胞用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的無菌DMEM 培養(yǎng)基置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀態(tài)傳代并更換新鮮DMEM 完全培養(yǎng)基。調(diào)整細胞密度并按每孔約1×106個細胞鋪于12 孔板中,待貼壁后,其中3 孔加入脂多糖(LPS)(終濃度為200 ng/ml),將細胞誘導成M1 型巨噬細胞,為LPS 誘導組;3 孔加入白細胞介素-4(IL-4)(終濃度為20 ng/ml),將細胞誘導成M2 型巨噬細胞,為IL-4 誘導組;對照組不加藥。誘導12 h 后提取RNA。按照同樣的方法將細胞誘導24 h 后提取蛋白,實驗重復3 次。
1.3.2 動物分組及處理將18 只ApoE-/-小鼠和18 只C57BL/6J 小鼠分成6 組,每組3 只ApoE-/-小鼠和3 只C57BL/6J 小鼠,其中C57BL/6J 小鼠為對照組。均喂食高脂飼料16 周后脫頸處死小鼠,心臟灌注5 ml 生理鹽水,將腹主動脈取出后,在體視顯微鏡下將腹主動脈外面的脂肪剝離干凈。其中3 組腹主動脈用于提取蛋白,另外3 組腹主動脈用于提取RNA,提取RNA 時不需要灌注,以免RNA 降解。同時取出ApoE-/-小鼠心臟竇部,用OCT 冷凍包埋劑包埋,置入-80℃冰箱冷凍保存,用于冷凍切片。
1.3.3 Western blotting 檢測eIF4E 蛋白相對表達量分別檢測各組細胞和小鼠腹主動脈中eIF4E 蛋白的相對表達量。采用裂解液(含PMSF)裂解細胞和組織(組織需勻漿),吹打均勻置冰上裂解30 min,4℃、12 000 r/min 離心15 min,取蛋白上清液,考馬斯亮藍法檢測蛋白濃度,剩余蛋白與上樣緩沖液按比例混勻,沸水浴5 min,置入-80℃冰箱冷凍保存。在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中進行蛋白分離,冰浴條件下轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h 后,加入一抗,4℃搖床孵育過夜。PBST 洗滌4次,加入相應的二抗,孵育1 h 后,PBST 洗4 次,ECL化學發(fā)光顯色,成像系統(tǒng)拍照,用Image J 軟件進行圖像分析。以目的條帶(eIF4E)與內(nèi)參(β-actin)條帶吸光面積積分的比值分析目的蛋白表達。在細胞水平檢測eIF4E 蛋白在M1 型、M2 型巨噬細胞和對照組中的表達;在動物組織水平上檢測eIF4E 蛋白在ApoE-/-和對照組中的表達。
1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測eIF4E mRNA 相對表達量分別檢測各組細胞和各組動物腹主動脈中eIF4E mRNA 的相對表達量。采用Trizol 法提取各組細胞和小鼠腹主動脈的總RNA(組織需勻漿),使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用TB GreenTMPremix Ex TaqTM進行qRT-PCR。eIF4E 引物:正向5'-AGGACGGTGGCTGATCACA-3',反向5'-TCTCTAGCC AGAAGCGATCGA-3';GAPDH 引物:正向5'-CAACTTT GGCATTGTGGAAGG-3',反向5'-ACACATTGGGGGT AGGAACAC-3'。以GAPDH 為內(nèi)參,用2-△△Ct法計算mRNA 相對表達量。所有實驗重復3 次,每次設3 個生物學重復。在細胞水平檢測eIF4E mRNA 在M1 型、M2 型巨噬細胞和對照組中的表達;在動物組織水平檢測eIF4E mRNA 在ApoE-/-和對照組中的表達。
1.3.5 組織免疫熒光檢測eIF4E 與M1 和M2 型巨噬細胞共定位表達將心臟竇部用冷凍切片機切6mm 厚,4%多聚甲醛固定15min,PBST 洗5min/次,洗3 次;0.25% Triton X-100 破膜5 min,5%封閉液室溫封閉1 h;孵育兔源一抗CD206/CD86(兔源,1∶100)和eIF4E(小鼠源,1 ∶300)混合液,4℃過夜;第2 天,先室溫平衡30 min,然后用PBST 洗5 min/次,洗3 次;室溫孵育熒光二抗488(山羊抗鼠,1 ∶100)和594(山羊抗兔,1∶100)混合液1 h,PBST洗5 min/次,洗3次;孵育DAPI 5 min,PBST 洗5 min/次,洗3 次;抗熒光淬滅劑封片,倒置熒光顯微鏡觀察拍照。在組織上檢測eIF4E 在M1 型和M2 型巨噬細胞中的共表達。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,比較用獨立樣本t檢驗或方差分析,進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
對照組、IL-4 誘導組和LPS 誘導組細胞中eIF4E mRNA 相對表達量分別為(1.010±0.157)、(2.102±0.375)和(5.832±0.774),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=23.329,P=0.000),進一步兩兩比較,LPS誘導組eIF4E mRNA 表達高于IL-4 誘導組(P<0.05)。對照組、IL-4 誘導組和LPS 誘導組eIF4E 蛋白相對表達量分別為(0.130±0.032)、(0.261±0.131)和(0.606±0.134),經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=12.834,P=0.011),進一步兩兩比較,LPS 誘導組eIF4E蛋白表達高于IL-4 誘導組(P<0.05)。見圖1。
對照組和ApoE-/-小鼠腹主動脈中eIF4E mRNA 相對表達量分別為(0.927±0.146)和(6.414±0.297),經(jīng)獨立樣本t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=-33.174,P=0.000),ApoE-/-小鼠腹主動脈中eIF4E mRNA 表達高于對照組;對照組和ApoE-/-小鼠腹主動脈中eIF4E 蛋白相對表達量為(0.225±0.078)和(2.342±0.594),經(jīng)獨立樣本t檢驗,差異有統(tǒng)計學意義(t=-6.122,P=0.004),ApoE-/-小鼠腹主動脈中eIF4E 蛋白表達高于對照組。見圖2。
圖1 各組細胞中eIF4E mRNA 和蛋白的表達
ApoE-/-小鼠主動脈根部切片免疫熒光結(jié)果顯示eIF4E 與CD86 的共定位比eIF4E 與CD206 的共定位表達多,eIF4E 在M1 型巨噬細胞中的含量高于M2 型巨噬細胞。見圖3。
圖2 各組小鼠腹主動脈中eIF4E mRNA 和蛋白的表達
圖3 eIF4E 與M1 型和M2 型巨噬細胞共表達 (免疫熒光×100)
動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥,炎癥在動脈粥樣硬化的各個階段都發(fā)揮重要作用。在動脈粥樣硬化發(fā)展和進展期間,巨噬細胞暴露于許多環(huán)境信號[18]?;谄湓诎邏K內(nèi)的定位和分布,巨噬細胞展現(xiàn)不同的極化狀態(tài)和功能表型[19]。目前,治療動脈粥樣硬化的藥物主要是降脂及抗凝等,但療效不理想,因此仍需從基因水平和細胞分子方面探索動脈粥樣硬化新療法。
真核生物基因表達調(diào)控的一種機制是控制翻譯速率,翻譯調(diào)控在細胞生長、增殖和發(fā)育中起著關鍵作用??梢栽诜g的起始、伸長和終止中的每一步控制翻譯速率[20]。在翻譯起始時,需要大量的真核翻譯起始因子的協(xié)作才能完成。其中異源三聚體復合物eIF4F 中的eIF4E 與mRNA 5'-端帽子結(jié)構的結(jié)合是該階段的核心。已有研究表明,eIF4E 抑制性蛋白能夠通過雷帕霉素復合物1-eIF4E 結(jié)合蛋白1/2 軸協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄,從而編碼限制巨噬細胞中抗炎反應的轉(zhuǎn)錄程序。而eIF4E 通過與eIF4E 抑制性蛋白的結(jié)合而破壞翻譯的起始過程,抑制mRNA 翻譯。翻譯抑制已成為炎癥反應的中樞調(diào)節(jié)機制[21-22]。
本研究用分別LPS 和IL-4 誘導細胞分化成M1型和M2 型巨噬細胞后檢測2 種細胞中eIF4E 蛋白和mRNA 的表達差異,結(jié)果表明eIF4E 蛋白和mRNA 在M1 型巨噬細胞中的表達均高于M2 型巨噬細胞。M1型巨噬細胞通過促炎細胞因子等加速免疫細胞內(nèi)皮下招募和血管壁重塑,M2 型巨噬細胞通過抗炎細胞因子減緩動脈粥樣硬化并使斑塊穩(wěn)定。初步說明eIF4E主要通過M1 型巨噬細胞發(fā)揮促炎作用。在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中,eIF4E 與CD86 的共定位表達比eIF4E 與CD206 的共定位表達多,且eIF4E 蛋白和mRNA 在ApoE-/-小鼠腹主動脈中表達也高于對照組。動物組織實驗結(jié)果驗證細胞實驗結(jié)果,進一步說明eIF4E 在動脈粥樣硬化疾病中起促炎調(diào)節(jié)作用。
綜上所述,eIF4E 通過調(diào)控巨噬細胞極化起到炎癥調(diào)控作用,其主要是通過調(diào)控M1 型巨噬細胞極化起到促炎調(diào)節(jié)作用。本研究僅從ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型做初步研究,后續(xù)會通過對小鼠eIF4E 和ApoE 雙基因敲除后,進一步探討其在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展中的具體作用以及相關通路,以期為臨床治療動脈粥樣硬化提供一定的理論依據(jù)。