楊靜文,劉澤暢,陳 培,杜偉棟,范效蘭,石 銘,劉玉梅*
(新疆大學(xué)化工學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830046)
啤酒花(Humulus lupulus.L)又名蛇麻花,是??拼舐閬喛迫劜輰僦参?,其球果是重要的啤酒原料,可賦予啤酒抑菌、防腐和增強(qiáng)泡持性等功效,同時(shí)為啤酒提供令人愉悅的苦味和香氣特征[1]。此外,啤酒花還具有較強(qiáng)的生理活性,國(guó)內(nèi)外對(duì)于啤酒花藥用價(jià)值的研究歷史悠久[2],臨床證實(shí)其具有良好的鎮(zhèn)靜和促進(jìn)睡眠的特性[3];德國(guó)草藥委員會(huì)于1984年將啤酒花列為治療焦慮和睡眠障礙等的有效植物[4]。我國(guó)明代《本草綱目》中就記載了啤酒花具有良好的食療作用,認(rèn)為其具有防治癆病、化痰止咳等功效。
啤酒花的主要成分包括軟/硬樹脂、精油、蛋白質(zhì)、多酚、蠟質(zhì)、纖維素和氨基酸等;其中軟樹脂是啤酒花中最主要的苦味組分[5],主要由α-酸和β-酸組成[6]。α-酸是啤酒花中最主要的成分,也是衡量啤酒花品種和品質(zhì)的重要依據(jù)。α-酸根據(jù)酰基側(cè)鏈的不同,主要存在3 種同系物,分別為合葎草酮、正葎草酮和加葎草酮。在麥汁煮沸過程中,α-酸會(huì)異構(gòu)化為水溶性更強(qiáng)的異α-酸,其對(duì)啤酒的苦味貢獻(xiàn)率約占80%左右。
與α-酸相同,β-酸同樣存在3 種主要同系物:合蛇麻酮、正蛇麻酮和加蛇麻酮,結(jié)構(gòu)如圖1所示。
圖1 β-酸3 種主要同系物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of β-acid homologues
與α-酸相比,β-酸在分子結(jié)構(gòu)上增加了一個(gè)異戊烯基,水溶性較差;同時(shí)由于β-酸結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)上不存在叔醇基團(tuán),不能發(fā)生類似α-酸的異構(gòu)化反應(yīng),被認(rèn)為對(duì)啤酒的苦味沒有貢獻(xiàn)[7-8],因此β-酸往往作為副產(chǎn)物從啤酒花中分離出來。但大量研究結(jié)果表明,β-酸具有抑菌、防腐、抗抑郁等生物活性,其中抑菌防腐性能主要是由于β-酸中存在的β-三酮基團(tuán)具有抑菌作用,可以影響菌類細(xì)胞壁的離子通透性[9]。Larson等[10]的研究結(jié)果表明,與α-酸及其衍生物相比,β-酸及其衍生物的抑菌活性更強(qiáng);Simpson等[11]的研究進(jìn)一步表明β-酸對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用是α-酸的兩倍。已有研究結(jié)果表明,β-酸具有廣譜抑菌性能,其在抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、牛鏈球菌等革蘭氏陰/陽性菌方面均體現(xiàn)出良好的性能[12-13]。而抗氧化活性方面的研究也發(fā)現(xiàn),β-酸對(duì)過氧化自由基和羥自由基均具有較強(qiáng)的清除能力[14-15];Sbardella等[16]的研究還證實(shí),β-酸對(duì)肉類具有較好的保鮮功效,可顯著降低肉制品的脂質(zhì)過氧化。本課題組前期對(duì)啤酒花中活性成分的抗氧化活性進(jìn)行研究也發(fā)現(xiàn),不同品種啤酒花的β-酸提取物在抗氧化活性上存在差異性[17],這可能正是不同品種啤酒花中β-酸3 種同系物的比例存在較大差異導(dǎo)致的。
盡管β-酸的3 種同系物結(jié)構(gòu)類似,但在活性上存在一定的差異[18]。例如,Schulz等[19]的研究結(jié)果表明,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量(60 kg)的人而言,合蛇麻酮、正蛇麻酮和加蛇麻酮作為膳食補(bǔ)充劑的推薦最大日服用劑量分別為9.3、7.3 mg和2.3 mg。相較于α-酸,人們對(duì)β-酸的研究較少[20];同時(shí)由于大量獲取β-酸同系物單體的難度較大,因此無論是從啤酒釀造還是從生理活性利用方面,人們往往將其作為一個(gè)整體進(jìn)行評(píng)價(jià),而對(duì)于β-酸同系物之間活性差異的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。對(duì)于β-酸的制備,目前較為成熟的方法是利用α-酸與β-酸的酸性差異,通過對(duì)啤酒花浸膏進(jìn)行分離來實(shí)現(xiàn),然而該方法只能獲得β-酸3 種同系物的混合體;而進(jìn)一步分離β-酸同系物,現(xiàn)行方法是利用制備型液相色譜來完成[21-22],然而該方法儀器昂貴,且利用該方法無法獲取大量的β-酸同系物單體,因此在很大程度上限制了后續(xù)研究和實(shí)際應(yīng)用。
本課題組以β-酸為研究對(duì)象已進(jìn)行了一定的研究報(bào)道[17,23]。由于不同品種啤酒花所含β-酸同系物的組成差異較大,因此本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,對(duì)β-酸同系物進(jìn)行了初步分離,得到不同比例β-酸同系物樣品,進(jìn)而采用不同的抗氧化評(píng)價(jià)方法和抑菌實(shí)驗(yàn),對(duì)β-酸同系物的活性進(jìn)行比較研究,以期為啤酒花品種選育和β-酸的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。
金黃色葡萄球菌(26001)和大腸桿菌(44825)由烏魯木齊市疾病預(yù)防控制中心提供。
啤酒花浸膏標(biāo)準(zhǔn)品(ICE-3) 美國(guó)釀造化學(xué)家協(xié)會(huì);啤酒花浸膏 新疆三寶樂農(nóng)業(yè)科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;蘆丁、β-胡蘿卜素中國(guó)藥品生物制品檢定所;黃嘌呤氧化酶 上海源葉生物科技有限公司;別嘌呤醇 北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司;抗壞血酸 天津市博迪化工有限公司;甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
LB固體培養(yǎng)基自行配制(10 g/L蛋白胨、10 g/L瓊脂粉、5 g/L酵母浸粉、10 g/L的NaCl),于120 ℃高壓滅菌20 min,供抑菌實(shí)驗(yàn)使用。
高效液相色譜儀、色譜柱為Hypersil ODS2(150 mm×4.6 mm,4.5 μm) 大連依利特分析儀器有限公司;UV-5300PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;WGZ-XT濁度儀 杭州奇威儀器有限公司。
1.3.1 高效液相色譜分析條件
流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)∶V(體積分?jǐn)?shù)85%磷酸)=85∶15∶0.25;流速0.8 mL/min;柱溫室溫;紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)314 nm;進(jìn)樣量10 μL,采用啤酒花浸膏國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物,通過峰面積外標(biāo)法定量分析。
1.3.2β-酸樣品分離提取及初步純化
β-酸的分離提取方法參考本課題組前期研究[24]。稱取20 g啤酒花浸膏,加入10 mL無水乙醇,在50 ℃水浴中攪拌至溶液澄清透明;邊攪拌邊向其中滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的KOH溶液,調(diào)節(jié)pH值至13~14;再加約200 mL蒸餾水,充分?jǐn)嚢韬笤俅我?0% KOH溶液調(diào)節(jié)體系的pH值至13~14。將溶液靜置30 min,真空抽濾除去油狀物,得到澄清液體。上述過濾液在N2保護(hù)下攪拌,緩慢通入CO2,當(dāng)pH值達(dá)到8.2~8.5時(shí)停止通氣,繼續(xù)攪拌約1 h,靜置30 min,真空抽濾得白色粉末狀固體即為β-酸粗提物,質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于80%,于-18 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3 不同比例β-酸同系物樣品的分離
稱取約5 g的β-酸粗提物,預(yù)實(shí)驗(yàn)在考察溶劑、結(jié)晶溫度、pH值對(duì)β-酸重結(jié)晶產(chǎn)物中3 種同系物比例影響的基礎(chǔ)上,對(duì)β-酸粗提物進(jìn)行了進(jìn)一步的分離。獲得不同比例β-酸同系物樣品條件簡(jiǎn)述如下:1)合蛇麻酮與正蛇麻酮+加蛇麻酮的質(zhì)量比為1∶1。向β-酸粗提物樣品中逐滴滴加體積分?jǐn)?shù)90%甲醇溶液,體系保持在50 ℃至完全溶解,在室溫下(25 ℃)重結(jié)晶,重復(fù)上述過程3 次得產(chǎn)物1,記為S1∶1。2)合蛇麻酮與正蛇麻酮+加蛇麻酮質(zhì)量比為10∶1。向產(chǎn)物1中逐滴滴加體積分?jǐn)?shù)90%甲醇溶液,體系保持在50 ℃至完全溶解,在4 ℃下重結(jié)晶,重復(fù)上述過程3 次得產(chǎn)物2,記為S10∶1。3)合蛇麻酮與正蛇麻酮+加蛇麻酮質(zhì)量比為5∶1。由產(chǎn)物1與產(chǎn)物2按質(zhì)量比5∶22混合得產(chǎn)物3,記為S5∶1。4)合蛇麻酮與正蛇麻酮+加蛇麻酮質(zhì)量比為1∶4。在室溫下逐滴向產(chǎn)物1中滴加體積分?jǐn)?shù)90%甲醇溶液,至樣品完全溶解,向該溶液中緩慢通入CO2(1 mL/min),至溶液pH值約為6~7左右,停止通氣,過濾得產(chǎn)物4,記為S1∶4。5)合蛇麻酮與正蛇麻酮+加蛇麻酮質(zhì)量比為20∶1。逐滴向β-酸粗提物中滴加正己烷,體系保持在50 ℃至β-酸完全溶解,在4 ℃下重結(jié)晶,重復(fù)上述過程3 次得產(chǎn)物5,記為S20∶1。
1.3.4 抗氧化活性評(píng)價(jià)
1.3.4.1 抑制黃嘌呤氧化酶活性的測(cè)定
參考文獻(xiàn)[25]的方法。精確移取3.75 mL磷酸鹽緩沖溶液(50 mmol/L的KH2PO4/K2HPO4,pH 7.5),一式四份。一份加入2 mL蒸餾水記作0組;一份加入1 mL的18 mU/mL黃嘌呤氧化酶和1 mL蒸餾水,記作E組;一份加入1 mL的β-酸系列樣品溶液和1 mL蒸餾水,記作S組;最后一份加入1 mL的β-酸系列樣品溶液和1 mL的18 mU/mL黃嘌呤氧化酶,記作E+S組。將4 組體系均置于37 ℃水浴中恒溫保持15 min,水浴結(jié)束加入3 mL黃嘌呤啟動(dòng)反應(yīng),混勻后立即在290 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度,記作0時(shí)刻,4 組體系的吸光度分別記為A0、AE0、AS0、A(E+S)0。然后將4 組體系放入25 ℃水浴,以100 r/min振蕩反應(yīng)30 min,反應(yīng)結(jié)束后加入1 mL 1 mol/L鹽酸終止反應(yīng),再次測(cè)定吸光度,記作30時(shí)刻,4 組體系的吸光度分別記為A30、AE30、AS30、A(E+S)30。根據(jù)公式(1)計(jì)算不同質(zhì)量濃度的β-酸系列樣品對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制率。
1.3.4.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定
參考文獻(xiàn)[26]的方法,以蘆丁作為對(duì)照,分別考察不同質(zhì)量濃度β-酸系列樣品的DPPH自由基清除率,按公式(2)進(jìn)行計(jì)算。
式中:As為加入樣品時(shí)的吸光度;Ab為未加樣品時(shí)的吸光度。
1.3.4.3 ·OH清除能力測(cè)定
β-酸系列樣品的·OH清除能力采用鄰二氮菲/Fe2+氧化法進(jìn)行評(píng)價(jià)[27],以蘆丁作為對(duì)照,以1 mL 體積分?jǐn)?shù)0.01%的H2O2和1 mL蒸餾水代替2 mLβ-酸樣品測(cè)得未損傷管吸光度,以2 mL蒸餾水代替2 mLβ-酸樣品測(cè)得損傷管的吸光度。根據(jù)公式(3)計(jì)算不同質(zhì)量濃度β-酸系列樣品·OH清除率。
式中:A2是加入樣品時(shí)溶液的吸光度;A1是以蒸餾水代替β-酸樣品時(shí)溶液的吸光度;A0是以蒸餾水代替β-酸樣品和體積分?jǐn)?shù)0.01% H2O2時(shí)溶液的吸光度。
1.3.4.4 總抗氧化能力評(píng)價(jià)
β-酸系列樣品的總抗氧化能力采用β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液法進(jìn)行評(píng)價(jià)[17],以蘆丁作為對(duì)照,根據(jù)公式(4)計(jì)算不同樣品的抗氧化指數(shù)(antioxidant activity index,AAI),評(píng)價(jià)樣品的總抗氧化能力。
式中:ASt和ACt分別表示120 min時(shí)樣品和蒸餾水(空白)的吸光度;AS0和AC0分別表示起始時(shí)樣品與空白的吸光度。
1.3.5 抑菌活性評(píng)價(jià)
1.3.5.1 菌懸液的配制
金黃色葡萄球菌和大腸桿菌懸濁液的配制參考前期工作[28],配制濃度為108~109CFU/mL的菌懸液,備用。
1.3.5.2 最小抑菌濃度的測(cè)定
采用濾紙片法[29]和二倍稀釋法[30],確定β-酸系列樣品的最小抑菌濃度。利用二倍稀釋法分別配制質(zhì)量濃度為2.00、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 mg/L和160.00 mg/L不同比例β-酸同系物樣品的甲醇溶液。將5.00 μL的樣品溶液滴于直徑為6 mm的圓形濾紙片上,待溶劑揮發(fā)后間隔一定距離貼在LB培養(yǎng)基上。陽性對(duì)照為160.00 mg/L(與樣品最大質(zhì)量濃度相同)的阿莫西林水溶液,以及75%乙醇溶液;陰性對(duì)照為甲醇和無菌水。將上述LB培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中,在37 ℃下培養(yǎng)24 h后,以十字交叉法測(cè)量各樣品對(duì)兩個(gè)菌種的抑菌圈直徑,抑菌圈直徑大于6.5 mm時(shí)認(rèn)為樣品對(duì)菌種有抑制作用。
所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Origin 8.5或Excel軟件處理,通過方差分析和鄧肯氏多重差異分析法分析顯著性,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示??寡趸钚缘难芯恐?,比較相鄰樣品之間的半數(shù)清除率(half maximal inhibitory concentration,IC50),當(dāng)P<0.01時(shí),即存在極顯著性差異,記為“<<或>>”;0.05<P<0.01時(shí),即存在顯著性差異,記為“<或>”;P>0.05時(shí),即不存在顯著性差異,記為“≈”。
由于啤酒花中加蛇麻酮在β-酸中的相對(duì)含量較為恒定,同時(shí)正蛇麻酮與加蛇麻酮的分離難度較大,因此通常將正蛇麻酮和加蛇麻酮看作一個(gè)整體進(jìn)行研究[31-32]。圖2為啤酒花浸膏標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)用啤酒花浸膏、β-酸粗提物,以及樣品S1∶4、S1∶1、S5∶1、S10∶1和S20∶1的液相色譜圖;其中,啤酒花浸膏標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)用啤酒花浸膏以及β-酸粗提物各組分的相對(duì)含量見表1。研究結(jié)果表明,在β-酸同系物樣品分離過程中,以體積分?jǐn)?shù)90%甲醇溶液作為溶劑進(jìn)行提取分離時(shí),當(dāng)結(jié)晶溫度由25 ℃降至4 ℃,β-酸粗提物重結(jié)晶后S1∶1比S10∶1中合蛇麻酮的相對(duì)含量明顯升高,證實(shí)合蛇麻酮的溶解度小于正蛇麻酮+加蛇麻酮;當(dāng)以正己烷作為溶劑進(jìn)行提取分離時(shí),β-酸粗提物重結(jié)晶后合蛇麻酮(S20∶1)的相對(duì)含量較體積分?jǐn)?shù)90%甲醇提取分離樣品(S10∶1)相對(duì)含量明顯升高,由于正己烷對(duì)含有β-酸的軟樹脂具有更好的溶解度,因此該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)合蛇麻酮的溶解度小于正蛇麻酮+加蛇麻酮;而當(dāng)在合蛇麻酮與正蛇麻酮+加蛇麻酮質(zhì)量比為1∶1的體積分?jǐn)?shù)90%甲醇溶液中通入CO2至pH值約為6~7左右時(shí),沉淀物中正蛇麻酮+加蛇麻酮的相對(duì)含量明顯提高,結(jié)果表明該組分的酸性強(qiáng)于合蛇麻酮。
圖2 樣品的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatograms of β-acid samples
表1 酒花浸膏標(biāo)準(zhǔn)品、實(shí)驗(yàn)用啤酒花浸膏和β-酸粗提物中各組分的相對(duì)含量Table 1 β-Acid composition of hops extract standard, hops extract used for this experiment and crude β-acid extract%
2.2.1 不同比例β-酸同系物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用
黃嘌呤氧化酶是人體內(nèi)核酸分解代謝中的重要組分,能催化(次)黃嘌呤產(chǎn)生尿酸[33],同時(shí)代謝產(chǎn)物會(huì)引起氧化應(yīng)激[34],兩者都是導(dǎo)致痛風(fēng)的重要因素[35]。目前臨床治療痛風(fēng)的藥物主要有別嘌呤醇[36]、秋水仙素[37]、半胱氨酸[38]等。但這些藥物具有較強(qiáng)的毒副作用,因此尋找高效低毒的新型抑制劑備受關(guān)注[39]。由圖3可知,β-酸對(duì)黃嘌呤氧化酶的活性具有一定的抑制作用,隨著質(zhì)量濃度的增加,所有樣品對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制率呈明顯上升趨勢(shì),且β-酸同系物的比例顯著明顯影響樣品對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制能力。由圖3可知,幾種β-酸同系物樣品抑制黃嘌呤氧化酶的IC50依次為S1∶4(0.50 mg/mL)<S1∶1(0.53 mg/mL)<S5∶1(0.65 mg/mL)≈S20∶1(0.63 mg/mL)<S10∶1(0.94 mg/mL),即隨著正蛇麻酮+加蛇麻酮比例的下降抑制能力總體逐漸減小,表明正蛇麻酮+加蛇麻酮對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制能力高于合蛇麻酮。盡管S1∶4樣品對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制能力明顯高于其他樣品,但與陽性對(duì)照品別嘌呤醇相比活性明顯較差。Mir等[40]以十六烷基三甲基溴化銨為例,研究同系物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用,結(jié)果表明,同系物的分子鏈長(zhǎng)短、分子質(zhì)量會(huì)顯著影響其與黃嘌呤氧化酶的結(jié)合,進(jìn)而影響其抑制活性;柳高[41]對(duì)B族維生素對(duì)小鼠尿酸水平影響的研究結(jié)果也證明B族維生素同系物之間在抑制黃嘌呤氧化酶上存在顯著性差異,上述研究均與本研究結(jié)果相似。
圖3 不同比例β-酸同系物樣品對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制率Fig.3 Inhibitory effect of β-acid homologue mixtures with different ratios on xanthine oxidase activity
2.2.2 不同比例β-酸同系物對(duì)DPPH自由基清除能力的影響
圖4 不同比例β-酸同系物樣品對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.4 DPPH radical scavenging rates of β-acid samples with different ratios of homologues
由圖4可知,β-酸對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力,隨著質(zhì)量濃度的增加,所有樣品對(duì)DPPH自由基的清除率均呈上升趨勢(shì),且β-酸同系物的比例明顯影響樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力。β-酸同系物樣品清除DPPH自由基的IC50依次為S1∶4(0.033 mg/mL)<S5∶1(0.042 mg/mL)<S1∶1(0.054 mg/mL)≈S20∶1(0.057 mg/mL)<S10∶1(0.077 mg/mL),清除能力均低于陽性對(duì)照品蘆?。?.015 mg/mL)。與抑制黃嘌呤氧化酶活性類似,正蛇麻酮+加蛇麻酮比例較高的樣品S1∶4清除DPPH自由基的能力較強(qiáng)。Ma Yongkai等[42]在研究抗氧化肽同系物的抗氧化活性過程中發(fā)現(xiàn),抗氧化肽清除DPPH自由基的能力不僅與氨基酸的組成和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)有關(guān),而且還與抗氧化肽的空間構(gòu)型以及同系物分子質(zhì)量有關(guān),表明同系物之間在清除DPPH自由基能力上存在差異,這與本研究結(jié)果類似。
2.2.3 不同比例β-酸同系物對(duì)·OH清除能力的影響
圖5 不同比例β-酸同系物樣品對(duì)·OH的清除率Fig.5 OH radical scavenging rates of β-acid samples with different ratios of homologues
由圖5可知,β-酸也具有較好的·OH清除能力。隨著質(zhì)量濃度的增加,所有樣品對(duì)·OH的清除率均呈上升趨勢(shì),且β-酸同系物的比例與·OH的清除能力也呈現(xiàn)一定相關(guān)性。5 種不同比例β-酸同系物樣品清除·OH的IC50依次為S1∶4(0.52 mg/mL)<S5∶1(0.61 mg/mL)≈S10∶1(0.64 mg/mL)<S1∶1(0.89 mg/mL)≈S20∶1(0.91 mg/mL),但清除能力均明顯小于陽性對(duì)照樣品蘆丁。與前述結(jié)果類似,正蛇麻酮+加蛇麻酮比例較高的樣品S1∶4樣品清除活性也是最強(qiáng)的,表明正蛇麻酮+加蛇麻酮對(duì)·OH的清除能力強(qiáng)于合蛇麻酮。Yeung等[43]在對(duì)甲酚類化合物抗氧化性能的研究過程中發(fā)現(xiàn),甲酚類同系物之間在清除·OH和超氧化物等的能力上也存在明顯差別,與本研究結(jié)果類似。
2.2.4 不同比例β-酸同系物的總抗氧化活性
由圖6可知,β-酸在胡蘿卜素-亞油酸乳化體系中具有較好的總抗氧化能力,隨著質(zhì)量濃度的增加,所有樣品的AAI均呈上升趨勢(shì),且β-酸同系物的比例對(duì)樣品的總抗氧化能力具有明顯影響。5 種樣品的總抗氧化活性達(dá)到50%時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度依次為S1∶4(0.43 mg/mL)<S20∶1(1.24 mg/mL)≈S5∶1(1.32 mg/mL)<S1∶1(1.74 mg/mL)<S10∶1(1.90 mg/mL),與陽性對(duì)照蘆?。?.623 mg/mL)相比,S1∶4樣品的總抗氧化能力更高,且S1∶4樣品抗氧化活性要明顯好于其他比例的樣品。該結(jié)果與前述各抗氧化評(píng)價(jià)體系中得出的正蛇麻酮+加蛇麻酮的抗氧化能力強(qiáng)于合蛇麻酮的結(jié)果一致。
圖6 不同比例β-酸同系物樣品的總抗氧化活性Fig.6 Total antioxidant activity of β-acid samples with different ratios of homologues
由表2可以看出,不同比例β-酸同系物樣品對(duì)所測(cè)試的2 種菌株均具有良好的抑菌活性,而空白溶液(甲醇、無菌水)對(duì)兩種菌株均無抑菌作用,陽性對(duì)照160.00 mg/L的阿莫西林溶液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為(16.9±0.4)mm和(15.7±0.3)mm。
表2 不同比例β-酸同系物樣品的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of bacteriostatic zone of β-acid samples with different ratios of homologuesmm
由表2可知,S1∶4對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為5.00 mg/L,其余樣品的最小抑菌濃度均為10.00 mg/L。但隨著樣品的質(zhì)量濃度增大,合蛇麻酮比例較高的樣品S10∶1和S20∶1的抑菌活性增加明顯,且在160.00 mg/L下,S10∶1的抑菌圈直徑與同質(zhì)量濃度的陽性對(duì)照阿莫西林對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力無顯著差異(P>0.05)。對(duì)于大腸桿菌而言,所有樣品的最小抑菌濃度均為10.00 mg/L;當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為160.00 mg/L時(shí),除S1∶4樣品外,其他幾種樣品對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑均與同質(zhì)量濃度的陽性對(duì)照阿莫西林相當(dāng),甚至更好,同樣說明合蛇麻酮比例的提高對(duì)抑制大腸桿菌生長(zhǎng)更為有利。Bocquet等[32]研究了合葎草酮與正葎草酮+加葎草酮和合蛇麻酮與正蛇麻酮+加蛇麻酮對(duì)小麥葉枯病菌(Zymoseptoria tritic)的抑制效果,結(jié)果表明合葎草酮和合蛇麻酮的IC50均小于對(duì)應(yīng)的正葎草酮+加葎草酮/蛇麻酮組分,因此推測(cè)合葎草酮/蛇麻酮的抗真菌活性較強(qiáng);但該實(shí)驗(yàn)中合蛇麻酮的半數(shù)抑菌濃度為660 mg/L,質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于本研究,證明β-酸系列組分對(duì)細(xì)菌的抑制活性遠(yuǎn)高于真菌。此外,也有研究發(fā)現(xiàn),青霉素在質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí),對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為24.0 mm和34.7 mm[44],但其質(zhì)量濃度約高于本實(shí)驗(yàn)100 倍。因此,作為一種有效的抑菌劑,β-酸具有很好的應(yīng)用前景。
本研究對(duì)啤酒花軟樹脂中不同比例β-酸同系物樣品的體外抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,β-酸具有良好的體外抗氧化活性,且其同系物比例的差異在抗氧化活性上存在較大差異;IC50結(jié)果表明,高比例正蛇麻酮+加蛇麻酮樣品S1∶4在4 種體外抗氧化評(píng)價(jià)體系中均顯示出最高的活性,證實(shí)正蛇麻酮+加蛇麻酮的抗氧化活性強(qiáng)于合蛇麻酮。同樣,不同比例β-酸同系物樣品的抑菌活性也存在差異。與抗氧化活性不同,在較高質(zhì)量濃度下(≥40.00 mg/L),高比例合蛇麻酮的β-酸樣品對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性均較強(qiáng),與同質(zhì)量濃度下的陽性對(duì)照阿莫西林的抑菌效果相當(dāng)甚至更高。但高比例正蛇麻酮+加蛇麻酮的β-酸樣品S1∶4對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度最低(5.00 mg/L);盡管S1∶4對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度與其余樣品均為10.00 mg/L,但其抑菌圈直徑更大。本研究結(jié)果可為啤酒花的品種選育和β-酸的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。但為深入闡明β-酸同系物之間活性差異的本質(zhì),仍需對(duì)上述同系物在分離純化、結(jié)構(gòu)表征以及構(gòu)效關(guān)系研究等方面開展更加深入細(xì)致的工作。