王芳 余柯達(dá) 楊麗華 何健英 毛佳婷 鄒立波

多囊卵巢綜合征（PCOS）是一種與女性激素代謝失調(diào)有關(guān)的疾病，在世界范圍內(nèi)育齡婦女中發(fā)病率約5%～10%［1］。PCOS患者通常表現(xiàn)為無(wú)排卵、高雄激素水平、月經(jīng)不調(diào)，閉經(jīng)及痤瘡等癥狀，而這些癥狀促使PCOS成為不孕癥的主要原因之一［2］。PCOS還與胰島素抵抗、肥胖及血脂異常密切相關(guān)，并增加2型糖尿病和心血管疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)報(bào)道，遺傳背景、環(huán)境因素、慢性炎癥及氧化應(yīng)激均與PCOS的發(fā)生有關(guān)［3］。研究表明，PCOS中顆粒細(xì)胞（GCs）的失調(diào)可能是卵泡發(fā)生異常和雄激素產(chǎn)生過(guò)量的原因之一［4］。因此，探索GCs細(xì)胞潛在的發(fā)病機(jī)制具有臨床意義。MicroRNAs（miRs）是一類由內(nèi)源基因組序列編碼的非編碼RNA分子，miRs參與較多疾?。ò≒COS）的病理進(jìn)展過(guò)程，因此有望成為PCOS診斷新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［5］。本研究比較PCOS患者和同齡健康女性外周血中miR-105-3p的表達(dá)水平，并通過(guò)轉(zhuǎn)染人卵巢顆粒細(xì)胞（KGN）細(xì)胞，觀察過(guò)表達(dá)miR-105-3p對(duì)KGN細(xì)胞增殖凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年10月至2019年9月本院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的PCOS患者30例，PCOS的診斷基于2003年修訂的鹿特丹歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)/美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)，收集同齡健康女性30例作為對(duì)照組。記錄臨床信息和生化結(jié)果。本項(xiàng)目經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）qRT-PCR：采用Trizol法提取外周血中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行 qRT-PCR。MiR-105-3p上游引物：5'-TGTGCATCGTGGTCAAATGCTCAGA-3'，下游引物：5'-TAGACACCGTAGCACATGCTCAAAC-3'；以U6核內(nèi)小RNA作為內(nèi)參基因，U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。（2）KGN細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染、細(xì)胞增殖和凋亡試驗(yàn)：采用lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-105-3p mimics和mimics negative，轉(zhuǎn)染48h后消化各組KGN細(xì)胞，并用qRT-PCR測(cè)定miR-105-3p的表達(dá)變化。細(xì)胞增殖試驗(yàn)采用MTT比色法觀察細(xì)胞增殖情況，于轉(zhuǎn)染24h、48h、72h和96h測(cè)定在480nm波長(zhǎng)處的吸光度。細(xì)胞凋亡試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞凋亡情況，檢測(cè)在450nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。qRTPCR數(shù)據(jù)采用7500 Software v2.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。計(jì)量資料以（±s）表示。兩組比較用雙尾獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料及生化指標(biāo) PCOS組與對(duì)照組的平均年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，PCOS組體質(zhì)量指數(shù)、黃體生成素、雌二醇、催乳素、總睪酮及游離睪酮含量、卵巢體積和卵巢濾泡數(shù)均較高（P＜0.05），而卵泡刺激素含量和每年月經(jīng)次數(shù)則較低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 臨床資料及生化指標(biāo)比較（±s）

表1 臨床資料及生化指標(biāo)比較（±s）

項(xiàng)目 PCOS組（n=30） 對(duì)照組（n=30） P值年齡（歲） 26.43±3.09 25.17±4.10 ＞0.05體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2） 22.57±3.80 20.22±3.49 ＜0.05卵泡刺激素（IU/L） 5.31±1.02 6.92±1.38 ＜0.05黃體生成素（IU/L） 10.79±3.50 7.32±2.77 ＜0.05雌二醇（ng/L） 83.10±13.22 35.08±9.91 ＜0.05催乳素（μg/L） 27.95±7.38 13.84±5.21 ＜0.05總睪酮（μg/L） 1.12±0.02 0.48± 0.09 ＜0.05游離睪酮含量（ng/L） 19.60± 4.83 5.32±1.51 ＜0.05卵巢體積（cm3） 10.05±3.24 6.18±1.50 ＜0.05卵巢濾泡數(shù)（個(gè)） 15.82±4.29 4.30±1.48 ＜0.05每年月經(jīng)數(shù)（次） 5.73±1.72 9.41±2.06 ＜0.05

2.2 miR-105-3p相對(duì)表達(dá)量 PCOS組外周血中miR-105-3p的表達(dá)量為（0.29±0.15），而對(duì)照組為（1.0±0.31），miR-105-3p在PCOS患者外周血中的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組外周血中miR-105-3p表達(dá)比較

2.3 KGN細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 采用熒光顯微鏡觀察KGN細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-105-3p mimics和mimics negative的轉(zhuǎn)染效率，miR-105-3p mimics和mimics陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞顯示大量綠色熒光，而空白對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)綠色熒光。再采用qRT-PCR分析KGN細(xì)胞中miR-105-3p的表達(dá)變化（見(jiàn)圖2），結(jié)果顯示KGN細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，miR-105-3p mimics轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中miR-105-3p的表達(dá)量幾乎為mimics陰性對(duì)照的16倍（P＜0.05）。

圖2 KGN細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-105-3p的表達(dá)量改變

2.4 過(guò)表達(dá)miR-105-3p對(duì)KGN細(xì)胞增殖和凋亡的影響 MTT比色法顯示（見(jiàn)圖3A），KGN細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics negative 24h、48h、72h和96h后細(xì)胞在480nm處的吸光度分別為（0.41±0.03）、（0.53±0.05）、（0.72±0.06）及（0.98±0.10），而miR-105-3p mimics后細(xì)胞吸光度僅為（0.33±0.04）、（0.45±0.06）、（0.60±0.05）及（0.87±0.07）。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)miR-105-3p mimics的吸光度均顯著低于mimics陰性對(duì)照（P＜0.05）。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定顯示KGN細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，miR-105-3p mimics的Caspase-3、Bax濃 度為（4.17±0.62）、（9.03±1.38）pg/ml，高于mimics陰性對(duì)照（P＜0.05），而miR-105-3p mimics的Bcl-2僅為（2.70±0.64）pg/ml，顯著低于mimics陰性對(duì)照（P＜0.05），見(jiàn)圖3B。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-105-3p對(duì)KGN細(xì)胞增殖（A）和凋亡（B）的影響

3 討論

PCOS是一種常見(jiàn)的生殖障礙，異常卵泡發(fā)生被認(rèn)為是PCOS最重要的病理特征。眾所周知，GCs細(xì)胞在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起十分關(guān)鍵的作用，目前研究已經(jīng)證明GCs細(xì)胞凋亡與PCOS的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［6］。因此，探究GCs凋亡的機(jī)制對(duì)臨床PCOS的防治具有重要價(jià)值。MiRs是一類長(zhǎng)度為21～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA序列，并且通過(guò)影響mRNA的穩(wěn)定性或翻譯過(guò)程在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近年來(lái)，有關(guān)PCOS與miRs表達(dá)異常的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。Roth等［7］通過(guò)對(duì)卵泡液微陣列分析顯示235個(gè)miRs在PCOS患者和正常女性中呈現(xiàn)差異表達(dá)，其中miR-32、miR-34c、miR-135a、miR-18b和miR-9在PCOS患者卵泡液中顯著高于正常女性卵泡液。Long等［8］發(fā)現(xiàn)PCOS患者外周血中miR-222，miR-146a和miR-30c的表達(dá)水平較正常對(duì)照組女性外周血顯著增加。Murri等［9］研究發(fā)現(xiàn)，與體型較瘦PCOS患者相比，肥胖PCOS患者外周血中miR-21、miR-27b、miR-103和miRNA-155的表達(dá)水平均顯著增加。上述結(jié)果表明miRs在PCOS中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并與PCOS病理過(guò)程密切相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-105在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并發(fā)揮抑癌或者促癌作用［10-11］。miR-105-3p屬于miR-105的成熟體之一，根據(jù)之前的深度測(cè)序報(bào)道，miR-105-3p在PCOS患者中的表達(dá)顯著低于健康對(duì)照組女性，提示該miR可能在PCOS發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，PCOS患者體質(zhì)量指數(shù)、黃體生成素、雌二醇、催乳素、總睪酮及游離睪酮含量、卵巢體積和卵巢濾泡數(shù)均較健康女性高（P＜0.05），而卵泡刺激素含量和每年月經(jīng)次數(shù)較健康女性低（P＜0.05），表明PCOS患者類固醇激素含量及月經(jīng)明顯異常。同時(shí)，miR-105-3p在PCOS患者外周血中的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），該結(jié)果與Xue等［12］報(bào)道結(jié)果完全一致，表明miR-105-3p在PCOS中呈現(xiàn)明顯低表達(dá)狀態(tài)。

在卵巢卵泡發(fā)育過(guò)程中，＞99%的卵泡發(fā)生退行性閉鎖，僅少數(shù)卵泡能夠排卵，已經(jīng)證明GCs細(xì)胞的凋亡與卵泡閉鎖有關(guān)［6］。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRs參與卵巢GCs細(xì)胞的增殖、分化和凋亡［13］。本研究MTT比色法顯示，轉(zhuǎn)染miR-105-3p mimics的KGN細(xì)胞在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的吸光度均顯著小于mimics陰性對(duì)照（P＜0.05），表明過(guò)表達(dá)miR-105-3p mimics可顯著抑制KGN細(xì)胞增殖。細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-105-3p mimics KGN細(xì)胞的Caspase-3和Bax的濃度顯著高于mimics 陰性對(duì)照（P＜0.05），Bcl-2反之，提示過(guò)表達(dá)miR-105-3p mimics可顯著促進(jìn)KGN細(xì)胞凋亡。表明低表達(dá)miR-105-3p主要通過(guò)抑制GCs細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡進(jìn)而調(diào)控PCOS的病理過(guò)程。

綜上所述，miR-105-3p在PCOS患者外周血中表達(dá)下調(diào)，體外過(guò)表達(dá)miR-105-3p可顯著抑制KGN細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)凋亡，提示miR-105-3p與PCOS病理過(guò)程密切相關(guān)，并可能作為PCOS診治的新的候選物標(biāo)志物。本研究的下一步計(jì)劃將篩選miR-105-3p的下游靶基因，并闡明其對(duì)靶基因的調(diào)控作用。