萬海山 代偉宏 黃澤曉 吳開弟 曹國良 何和與

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)以滑膜增生、炎性關節(jié)、軟骨和骨骼破壞為特征，是一種慢性炎性、全身性自身免疫疾病[1,2]。RA的病理機制是多方面的，涉及T細胞、B細胞、成纖維樣滑膜細胞(FLS)以及許多促炎性細胞因子的復雜相互作用。因此，揭示影響免疫調(diào)節(jié)和炎癥消退的途徑是更好地了解RA的病理生理學和設計治療這種嚴重關節(jié)疾病的新方法的主要關注點[3]。RA會導致關節(jié)畸形和破壞,導致人們失去工作能力，甚至導致死亡[4]。盡管現(xiàn)有療法有一定效果，但部分RA患者對當前療法仍無有效反應，而且治療可能會引起嚴重的不良反應[5]。因此，有必要尋找治療RA的新策略。

蒲公英是多年生草本植物，用于治療急性結膜炎、皮膚潰瘍和其他炎性疾病[6]。蒲公英甾醇是一種從蒲公英中提取的活性化合物，其分子結構類似于類固醇激素，并且已被證明在體內(nèi)和體外均具有抗炎作用[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英甾醇在乳腺炎、胃炎等疾病中已有研究[8，9]。但是，目前關于蒲公英甾醇在RA中的研究報道很少。眾所周知，TLR4/NF-κB通路在炎性反應的調(diào)節(jié)中起著重要作用[6]。此外，TLR4可以激活關鍵的炎性介質(zhì)NF-κB來調(diào)節(jié)炎性反應[7]。TLR4/NF-κB在RA中已有研究，但是蒲公英甾醇對TLR4/NF-κB信號通路的研究甚少。

本實驗研究蒲公英甾醇對體外培養(yǎng)的人類風濕關節(jié)炎成纖維滑膜細胞(MH7A細胞)增殖、遷移和凋亡及TLR4/NF-κB信號通路的影響，進一步探討其作用機制，為未來蒲公英甾醇在臨床上治療RA提供新的理論依據(jù)。

材料與方法

1.細胞：人RA成纖維滑膜細胞系MH7A購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

2.試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司。蒲公英甾醇(HPLC≥98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。LPS購自美國Sigma公司。CCK-8試劑盒購自美國Gibco公司。5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine, EDU)試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自瑞士Roche公司。Transwell小室購自美國Promega公司。RIPA裂解液和BCA試劑盒購自英國Abcam公司。兔抗p-TLR4抗體、兔抗TLR4抗體、兔抗p-NF-κB p65抗體、兔抗NF-κB p65抗體、兔抗β-actin抗體和山羊抗兔IgG二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

3.細胞培養(yǎng)：MH7A細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，2天更換1次培養(yǎng)基，以保證細胞所需的營養(yǎng)成分。傳代3次后可以進行后續(xù)的實驗。

4.CCK-8法檢測蒲公英甾醇毒性：MH7A細胞以3×103個細胞接種到96孔板中，每孔100μl。根據(jù)蒲公英甾醇不同濃度將實驗分為0μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(0)組]、5μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(5)組]、10μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(10)組]、15μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(15)組]、20μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(20)組]和25μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(25)組]，每組3個復孔，置于37℃、5% CO2條件下孵育24h。將10μl CCK-8試劑加到每個孔中。2h后使用酶標儀在450nm處測量每孔細胞的吸光度(A)值，計算細胞活力。

5.細胞分組及培養(yǎng)：MH7A細胞以3×103個細胞接種到96孔板中，每孔100μl。細胞分為對照組(control組)、LPS組(1mg/ml)、LPS+蒲公英甾醇處理組(蒲公英甾醇質(zhì)量濃度為5、10和15μg/ml)，每組3個復孔。用藥組相應劑量的蒲公英甾醇預處理24h后，再加入LPS，置于37℃、5% CO2條件下孵育24h。細胞培養(yǎng)結束后，進行后續(xù)的實驗。

6.ELISA法檢測：實驗結束后收集各組細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀在450nm波長依序測定各孔的吸光度(A)值，根據(jù)A值所繪制的標準曲線查出上清液中TNF-α和IL-6的表達水平。

7.EDU檢測：MH7A按照1×105個/孔接種在6孔板中，按材料與方法3進行處理并置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育。實驗結束后，每孔加入100μl含50μmol/L EDU溶液的RPMI1640完全培養(yǎng)基孵育2h。之后各組細胞在4%多聚甲醛中固定30min，將各組細胞與2mg/ml甘氨酸孵育10min。接下來，將細胞用PBS沖洗，然后使用500μl 0.5% Triton-X透化10min，然后在黑暗中與Apollo染色液孵育30min。最后，將細胞與Hoechst 33342孵育30min，并用0.5% Triton-X沖洗兩次。在熒光顯微鏡下觀察細胞并拍照。

8.Transwell遷移實驗：收集各組處理48h細胞，胰酶消化后制成單細胞懸液，細胞密度為1×106個/毫升。將Transwell小室加入細胞懸液100μl，下室加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基500μl。然后將Transwell小室置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育8h。取出聚碳酸酯微孔膜, 用棉簽輕輕擦去基底膠和上表面的細胞，然后中性甲醛固定，蘇木精染色。顯微鏡下隨機選取5個視野，計錄穿膜細胞數(shù)。以穿膜細胞數(shù)代表細胞遷移能力。

9.細胞流式術：在各組細胞處理48h后，將細胞用冰PBS沖洗1次，并在加入5μl Annexin Ⅴ-FITC和10μl PI之后再用300μl結合緩沖液重懸將細胞在在避光的室溫下孵育10min。進行流式細胞術以檢測細胞凋亡，并使用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

10.Western blot法：實驗結束后，棄去細胞上清液，PBS沖洗2次。加入1ml制備好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測定總蛋白含量。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1h后，將PVDF膜與以下抗體在4℃孵育過夜：兔抗p-TLR4抗體(1∶1000)、兔抗TLR4抗體(1∶1000)，兔抗p-NF-κB p65抗體(1∶1000)、兔抗NF-κB p65抗體(1∶1000)、兔抗β-actin抗體(1∶2000)。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，持續(xù)5min，并與山羊抗兔IgG-HRP(1∶5000)孵育1h，用TBST洗滌3次，持續(xù)5min。最后顯影曝光，用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進行分析。

結 果

1.蒲公英甾醇濃度的篩選：CCK-8結果表明，用不同濃度的蒲公英甾醇(0、5、10、15、20和25μg/ml)培養(yǎng)MH7A細胞24h時，0～15μg/ml時，MH7A細胞的細胞活力不受蒲公英甾醇處理的影響，但當蒲公英甾醇濃度在20和25μg/ml時，MH7A細胞的細胞活力受到影響(P=0.000)，因此后續(xù)實驗選擇蒲公英甾醇的濃度為5、10和15μg/ml(圖1)。

圖1 不同濃度蒲公英甾醇對MH7A細胞活力的影響與Tar(0)組比較，*P=0.000

2.蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞形態(tài)的影響：MH7A細胞經(jīng)LPS誘導后，細胞增殖率增加，細胞密度增加，細胞排列緊密；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細胞的增殖率降低，細胞密度減小(圖2)。

圖2 不同濃度蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞形態(tài)的影響(EDU,×100)

3.蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞炎性介質(zhì)分泌的影響：ELISA法檢測結果表明，與對照組比較，LPS組MH7A細胞上清中TNF-α和IL-6的含量顯著增加(P均=0.000)，造模成功；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇均能使MH7A細胞上清中TNF-α和IL-6的含量降低(P<0.05，圖3)。

圖3 蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞中TNF-α、IL-6分泌的影響與對照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

4.蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞增殖能力的影響：EDU結果顯示，與對照組比較，LPS組MH7A細胞中EDU陽性細胞數(shù)目比例顯著增加(P=0.000)；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細胞中EDU陽性細胞數(shù)目比例減少(P均<0.05，圖4)。

圖4 蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞增殖能力的影響(EDU,×200)與對照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01

5.蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞遷移能力的影響：Transwell遷移實驗結果顯示，與對照組比較，LPS組MH7A細胞的遷移數(shù)目顯著增加(P=0.000)；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細胞的遷移數(shù)目減少(P均<0.05，圖5)。

圖5 蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞遷移數(shù)目的影響(蘇木精染色，×200)與對照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.01，##P=0.000

6.蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞凋亡的影響：流式細胞術結果顯示，與對照組比較，LPS組MH7A細胞的凋亡率顯著減少(P=0.000)；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細胞的凋亡率增加(P均<0.05，圖6)。

圖6 蒲公英甾醇對LPS誘導的MH7A細胞凋亡的影響與對照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.01，##P=0.000

7.蒲公英甾醇抑制TLR4/NF-κB通路：Western blot法檢測結果顯示，與對照組比較，LPS組MH7A細胞中TLR4蛋白表達顯著增加(P=0.000)，NF-κB p65的磷酸化程度也顯著增加(P=0.000)；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細胞中TLR4蛋白表達下降(P均<0.05)，NF-κB p65的磷酸化程度也降低(P均<0.05，圖7)。

圖7 蒲公英甾醇抑制TLR4/NF-κB通路與對照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

討 論

RA是最常見的慢性炎性關節(jié)疾病，全世界的發(fā)生率是0.5%～1.0%，其特征主要是關節(jié)滑膜炎癥。反復滑膜炎可引起關節(jié)疼痛，關節(jié)強迫、僵硬和腫脹，疾病進展可導致關節(jié)軟骨和骨骼的破壞，此外，它可能會逐漸引起關節(jié)畸形和功能障礙[12]。FLS是滑膜的重要組成部分，在RA的病理過程中起主要作用。RA的主要病理特征之一是FLS異常增生，表現(xiàn)為滑膜組織增生[13]。在RA中觀察到FLS的凋亡不足和異常增殖，并且FLS的過量促進RA的各種病理過程[14]。因此，促進FLS的凋亡和抑制增殖是圍繞RA治療的當前研究的主要焦點。

本研究結果顯示，人類風濕關節(jié)炎成纖維滑膜細胞MH7A細胞經(jīng)LPS誘導后，細胞上清液中的炎性因子(TNF-α和IL-6)分泌增加，細胞異常增生，其增殖能力、遷移能力顯著增強，凋亡率顯著下降，與既往文獻報道一致[15]。

Toll樣受體是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[15]。TLR4能夠通過MyD88依賴性途徑促進干擾素-β的表達并激活NF-κB。在缺血和缺氧等條件下，TLR4被激活，進一步提高了NF-κB的磷酸化程度并激活了TLR4/NF-κB途徑，從而增加了炎性因子的含量[16]。NF-κB是炎性反應的關鍵轉錄因子，其可以在應激環(huán)境中被激活[17]。NF-κB主要通過動態(tài)核DNA /蛋白質(zhì)結合發(fā)揮其生物學功能。各種炎性因子，例如TNF家族成員都是NF-κB依賴性基因。因此，抑制NF-κB可以有效地阻斷炎癥途徑。研究發(fā)現(xiàn)，羥氯喹通過NF-κB信號通路抑制TNF-α誘導的MH7A細胞IL-6分泌和mRNA表達[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，MH7A細胞經(jīng)LPS誘導后，TLR4蛋白表達顯著增加，NF-κB p65的磷酸化程度也顯著增加，與既往文獻報道一致[19]。

蒲公英甾醇為蒲公英的主要有效成分，具有清除自由基、消炎、防腐、抗氧化、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化和保肝作用。蒲公英甾醇對乳腺炎具有發(fā)揮抗炎的作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英甾醇使LPS誘導的MH7A細胞上清中分泌的炎性因子表達量減少，細胞的增殖能力、遷移能力降低，凋亡率提高，TLR4蛋白表達下降，NF-κB p65的磷酸化程度也下降。

綜上所述，蒲公英甾醇通過抑制TLR4/NF-κB信號通路抑制了RA的發(fā)生、發(fā)展，從而抑制了MH7A細胞的增殖、遷移，促進其凋亡。因此，蒲公英甾醇可能對RA的發(fā)生、發(fā)展有抑制作用，尚需開展進一步實驗和臨床研究予以證實。