高志光 安 然 蔣杏麗 金 夢 焦 慧 李 峰 劉 錚 李明華

聲帶白斑(vocal cord leukoplakia)是臨床中的描述性診斷，是指在宏觀檢查中發(fā)現(xiàn)黏膜表面的白色斑塊。聲帶白斑包括多種病理變化，如過度角化、異型增生、原位癌和浸潤癌[1]。研究表明，臨床診斷為聲帶白斑的病例中有6%～7%的患者可能進(jìn)一步發(fā)展為癌癥[2]。相比于診斷為非異型增生的白斑，診斷為異型增生的白斑是潛在的癌前病變[3]。在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者中，血管生成抑制蛋白 VASH1(vasohibin-1)高表達(dá)的患者比低表達(dá)的患者無病生存期明顯縮短，VASH1的表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，可能是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后指標(biāo)[4]。Ki-67在喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，高表達(dá)的Ki-67可能是LSCC預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)[5]。在喉癌組織呈高表達(dá)的CD34可能成為喉癌早期診斷的指標(biāo)[6]。目前Vash1、Ki67、CD34對聲帶白斑的作用機(jī)制尚未明確。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法，研究Vash1、Ki67、CD34在聲帶白斑中的表達(dá)，及其與聲帶白斑復(fù)發(fā)和癌變之間的關(guān)系。

材料與方法

1.標(biāo)本來源：選擇2018年1月～2019年12月在黑龍江省醫(yī)院耳鼻喉科住院接受支撐喉鏡下聲帶白斑切除術(shù)、支撐喉鏡下聲帶息肉切除術(shù)患者共100例，其中聲帶白斑50例，聲帶息肉50例。所有患者術(shù)前均無頭頸部放療、化療及免疫治療史，無氣管插管、喉部手術(shù)史、外傷史，無全身其他部位惡性腫瘤，術(shù)后病理結(jié)果均由病理醫(yī)師嚴(yán)格確診。

2.方法：術(shù)中切除的病變標(biāo)本常規(guī)用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，給予連續(xù)切片，厚度4μm。抗體包括兔抗人Vash1多克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體、鼠抗人Ki67單克隆抗體。應(yīng)用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-peroxidase, S-P)免疫組織化學(xué)染色法，檢測聲帶白斑和聲帶息肉組織中Vash1、Ki67、CD34蛋白的表達(dá)。根據(jù)病理表現(xiàn)，將聲帶白斑組和聲帶息肉組分為兩個(gè)亞組，即非異型增生組和異型增生組，分析兩亞組間Vash1、Ki67、CD34的表達(dá)情況。

3.結(jié)果判定：在聲帶白斑和聲帶息肉組織中，Vash1陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀著色，Ki67陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色。選擇細(xì)胞染色清晰的組織切片，在光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡(×400)視野，在每個(gè)視野中計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分率。根據(jù)陽性細(xì)胞在病變的上皮細(xì)胞總數(shù)中所占的比例，確定陽性范圍：陽性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%為弱陽性(+)，陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%為陽性(++)，陽性細(xì)胞數(shù)>50%為強(qiáng)陽性(+++)[7]。CD34表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，其胞質(zhì)經(jīng)染色后呈棕黃色則為CD34陽性。參照Weidner[8]標(biāo)準(zhǔn)對微血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，在低倍鏡(×100)下，找到微血管分布集中處，選取5個(gè)不重復(fù)的高倍鏡(×200)視野，對微血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，取其平均值作為微血管密度值(microvessel density, MVD),即CD34-MVD值。

4.復(fù)查與隨訪：對50例聲帶白斑和50聲帶息肉患者進(jìn)行手術(shù)后復(fù)查和隨訪，時(shí)間為術(shù)后1、3、6、12個(gè)月，截止到2019年12月30日，復(fù)查時(shí)行電子喉鏡檢查，觀察是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)患者再次住院手術(shù)治療，切除標(biāo)本送病理檢查，觀察是否出現(xiàn)癌變。

結(jié) 果

1.Vash1在聲帶白斑和聲帶息肉組織中的表達(dá)：Vash1在聲帶白斑和聲帶息肉組織中的陽性表達(dá)，均表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀染色，兩組中的陽性表達(dá)率分別為82.00%(41/50)和74.00%(37/50)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.932，P=0.334)，詳見表1。在聲帶白斑組內(nèi)，非異型增生組與異型增生組間Vash1的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.709，P=0.400)，聲帶息肉組內(nèi)，兩亞組間Vash1的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.002，P=0.962)。

表1 Vash1在聲帶白斑和聲帶息肉組織中的表達(dá)情況

2.Ki67在聲帶白斑和聲帶息肉組織中的表達(dá)：Ki67陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核呈棕黃色，在聲帶白斑和聲帶息肉組織中表達(dá)的陽性率分別為84.00%(42/50)和58.00%(29/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.208，P=0.004)，詳見表2。在聲帶白斑組內(nèi)，非異型增生組與異型增生組間Ki67的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.303，P=0.038)，聲帶息肉組內(nèi)，Ki67在兩亞組間表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.516，P=0.473)。

表2 Ki67在聲帶白斑和聲帶息肉組織中的表達(dá)情況

3.CD34在聲帶白斑和聲帶息肉組織中的表達(dá):聲帶白斑和聲帶息肉組織中，CD34-MVD值分別為18.593±4.455和10.089±2.565，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.697,P=0.000，表3)。在聲帶白斑組內(nèi)，非異型增生組和異型增生組CD34-MVD值分別為16.612±2.267和20.919±4.597，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。在聲帶息肉組內(nèi)，非異型增生組和異型增生組CD34-MVD值分別為9.802±2.348和13.388±3.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)。

表3 CD34在聲帶白斑和聲帶息肉組織中的表達(dá)情況

4.Vash1、Ki67、CD34之間表達(dá)的相關(guān)性分析：在聲帶白斑病例組中，Ki67陽性率和CD34-MVD值之間呈正相關(guān)(r=0.526，P=0.000)，Vash1和Ki67陽性率之間呈低等程度正相關(guān)(r=0.378，P=0.007)，Vash1陽性率和CD34-MVD值之間不相關(guān)(r=0.259，P=0.069)。

5.Vash1、Ki67、CD34在聲帶白斑復(fù)發(fā)和癌變病例中的表達(dá)：50例聲帶白斑病例的隨訪中，有2例(4.00%)在隨訪第12個(gè)月時(shí)因電話停機(jī)失訪，2例(4.00%)隨訪時(shí)間不足12個(gè)月，在隨訪期內(nèi)未出現(xiàn)復(fù)發(fā)和癌變。46例聲帶白斑病例中，共11例(23.91%)在隨訪期間復(fù)發(fā)，隨訪第3個(gè)月復(fù)發(fā)1例(2.17%)，第6個(gè)月復(fù)發(fā)3例(6.52%)，第12個(gè)月復(fù)發(fā)7例(15.22%)。按照是否復(fù)發(fā)，將46例聲帶白斑患者分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組，兩組間Vash1的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.075)，Ki67在兩組間的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，CD34-MVD值在兩組間的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。46例聲帶白斑病例中，2例(4.35%)在隨訪第12個(gè)月時(shí)出現(xiàn)癌變，以是否出現(xiàn)癌變將46例聲帶白斑患者分為癌變組和未癌變組，Vash1在兩組間的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)，Ki67在兩組間的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)，CD34-MVD值在兩組間的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.085)。

討 論

聲帶白斑的病理表現(xiàn)呈多樣性，按照2005年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)修訂的頭頸部腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn),具體病理分類為非異型增生、輕度異型增生、中度異型增、重度異型增生、癌癥，2017年WHO藍(lán)皮書中引入了兩級分類，如“無/輕度異型增生”為低風(fēng)險(xiǎn)，“中度或重度異型增生”為高風(fēng)險(xiǎn)[9]。Vash1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，并起到終止血管生成的作用，由血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2, FGF-2)等血管生成刺激因子誘導(dǎo)[10]。在喉癌組織中的VEGF的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常喉黏膜組織[11]。在癌癥組織中，Vash1的表達(dá)強(qiáng)度與VEGF的表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)[10]。高表達(dá)的Vash1與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)[4,10,12～14]。Ki67是一種脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid, DNA)結(jié)合蛋白，主要位于細(xì)胞核，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。Ki67可能參與喉癌的癌變過程，在LSCC組織中的表達(dá)明顯高于鄰近非腫瘤組織，它可能是預(yù)測LSCC預(yù)后有價(jià)值的指標(biāo)[5]。CD34是一種單鏈高度糖基化型跨膜蛋白，存在于微血管內(nèi)皮細(xì)胞，能促進(jìn)新生血管的形成[15]。一項(xiàng)對72例LSCC患者的研究表明，CD34在LSCC組織中高表達(dá)，對LSCC的早期診斷和預(yù)后的判斷有重要意義[6]。

本研究發(fā)現(xiàn),Ki67和CD34在聲帶白斑組織中高表達(dá)，其中異型增生組比非異型增生組的表達(dá)更高，Ki67和CD34可能是聲帶白斑和癌前病變診斷的預(yù)測指標(biāo)。Vash1在聲帶白斑和聲帶息肉在兩組表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)，在聲帶白斑組內(nèi)，非異型增生和異型增生組間的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在聲帶息肉組內(nèi)兩亞組間出現(xiàn)相同的結(jié)果，Vash1在聲帶白斑和癌前病變的診斷中可能無法起到明顯的提示作用。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Ki67和CD34的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.526，P=0.000)，Vash1和Ki67的表達(dá)也呈正相關(guān)，但二者之間的相關(guān)關(guān)系較弱(r=0.378，P=0.007)，Vash1和CD34的表達(dá)不相關(guān)(r=0.259，P=0.069)。在聲帶白斑癌變病例的分析中發(fā)現(xiàn)，Vash1和Ki67的表達(dá)兩組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Vash1:P=0.019; Ki67:P=0.023)，CD34的表達(dá)在兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.085)，可能與樣本量過小有關(guān)。CD34-MVD值反映的是血管新生的能力，Vash1抑制微血管生成的作用由血管生成刺激因子(如VEGF等)誘導(dǎo)產(chǎn)生。因此可以推測，只有血管生成刺激因子的表達(dá)量升高到一定程度時(shí)，才會(huì)誘導(dǎo)Vash1的表達(dá)升高，因此也就可以認(rèn)為在聲帶白斑組織中Vash1表達(dá)尚未出現(xiàn)明顯升高，發(fā)展到喉癌才出現(xiàn)明顯高表達(dá)。聲帶白斑復(fù)發(fā)病例的分析表明，Ki67和CD34在白斑復(fù)發(fā)的發(fā)生中起到重要作用， Ki67和CD34可能是聲帶白斑復(fù)發(fā)的預(yù)測指標(biāo)。然而，本研究也存在局限性，研究中僅應(yīng)用了免疫組織化學(xué)染色法，今后仍需要開展更大樣本量、更長的隨訪時(shí)間以及核酸水平上的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，本研究認(rèn)為Ki67和CD34在白斑發(fā)生、復(fù)發(fā)的過程中起重要作用，可能是預(yù)測聲帶白斑發(fā)生、癌前病變診斷、復(fù)發(fā)的重要標(biāo)志物。Vash1和Ki67在聲帶白斑癌變的預(yù)測中可能也有重要作用。本研究為聲帶白斑及癌前病變的病理學(xué)診斷提供了理論支持，為預(yù)測其復(fù)發(fā)和癌變提供了潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)為進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究提供了研究基礎(chǔ)。