左文博，王嘉政，徐 穎，楊小婷，倪 維，胡 松

（1. 江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056；2. 湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061）

基因組DNA 作為遺傳物質(zhì)，可用于遺傳性疾病、胎兒產(chǎn)前無創(chuàng)傷診斷、腫瘤和傳染性疾病等的早期確診中［1］。DNA 的質(zhì)量和純度對于診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性有顯著影響。DNA 與組蛋白構(gòu)成核小體，核小體纏繞形成染色絲，染色絲與非組蛋白形成染色體，存在于細(xì)胞核中，外有核膜和細(xì)胞膜［2］。外周血提取DNA 的關(guān)鍵是分離出有核的細(xì)胞，通過破碎細(xì)胞膜和核膜，并去除細(xì)胞核中的非組蛋白和與DNA 結(jié)合的組蛋白，能獲得較純的DNA。目前有核細(xì)胞的分離方法有磷酸鹽緩沖液洗滌法、低滲液洗滌法、PBS 凍融法、TE 緩沖液洗滌法、密度梯度離心法分離PBMC（peripheral blood mononnuclear cell，以下簡稱全血PBMC DNA 提取法）［3］。由于血細(xì)胞中含有PBMC、粒細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板，而紅細(xì)胞和血小板不含DNA，通過分離PBMC 防止全血中紅細(xì)胞、血小板以及部分微生物DNA 干擾實(shí)驗(yàn)，因此分離PBMC 可以提高DNA 的質(zhì)量。PBMC DNA 提取法相對簡便，且分離后的細(xì)胞單純，無其他外源性核酸的干擾，較為適合基因分型檢測等實(shí)驗(yàn)操作［4］。

全血PBMC DNA 提取法，其原理是不同種類細(xì)胞顆粒之間存在沉降系數(shù)差，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶以獲得較為純凈的有核細(xì)胞成分，從而提取高質(zhì)量DNA，特別在淋巴細(xì)胞表型檢測（如HLA、KIR 等）、器官移植中的淋巴細(xì)胞交叉配型、科研中某種單核細(xì)胞的培養(yǎng)和人體DNA 的抽提都廣泛應(yīng)用此方法［5-7］。目前在實(shí)驗(yàn)中，一般采取一次性提取大批量臨床血液樣本DNA，對于實(shí)驗(yàn)流程中提取DNA 的效能、實(shí)驗(yàn)時間、實(shí)驗(yàn)安全性、費(fèi)用、設(shè)備要求和試劑等多種因素都有相應(yīng)考慮。當(dāng)在提取大批量臨床血液樣本過程中，全血PBMC DNA 提取法提取的實(shí)驗(yàn)時間過長、外周血樣本需求量較多、DNA 純度和質(zhì)量偏低等問題尤為明顯［8］。有研究［9］表明雙蒸水低滲透壓可幫助紅細(xì)胞裂解，有利于外周血的快速DNA 提取。因此本研究嘗試對已有試劑盒法改良，即使用雙蒸水裂解紅細(xì)胞配合試劑盒提取DNA，以下簡稱改良全血DNA 提取法。本實(shí)驗(yàn)通過比較兩種方法提取DNA 的時間、質(zhì)量、純度和凝膠電泳檢測結(jié)果來判斷后者是否能有效減少提取DNA 時間以及通過減少外周血的使用量來提高DNA 提取率，從而運(yùn)用于大樣本實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 樣本

由湖北省中醫(yī)院檢驗(yàn)科篩選無基礎(chǔ)疾病病史武漢地區(qū)人全血5 mL，通過EDTA 抗凝，- 40 ℃保存，總共80 份，隨機(jī)分為兩組，每組40 份，本實(shí)驗(yàn)志愿者均簽署知情同意書，經(jīng)湖北省中醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 全血PBMC DNA 提取法 選用- 40 ℃保存的武漢地區(qū)健康人全血，電熱恒溫水槽加熱，充分溶解，進(jìn)行PBMC 細(xì)胞分離操作。采用Ficoll- hypaque（聚蔗糖－泛影葡胺）密度梯度離心法分離［10］，用淋巴分離液（天津TBD）分離PBMC 細(xì)胞，然后按照天根試劑盒（天根生化科技北京有限公司）說明書提取DNA。

1.2.2 改良全血DNA 提取法 選用- 40 ℃保存的武漢地區(qū)健康人全血，電熱恒溫水槽加熱，充分溶解；洗滌：1 mL 全血加入0.5 mL 雙蒸水，充分混勻后，8 000 r/min 離心3 min，棄上清液，重復(fù)3次，直至EP 管內(nèi)液體紅色消失，收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照試劑盒說明書提取DNA。

1.3 基因組DNA 的檢測

1.3.1 DNA 提取的耗時分析 多次記錄DNA 提取時間，包括操作前準(zhǔn)備時間、操作時間及試劑盒時間，并求得各部分平均值。

1.3.2 核酸蛋白定量儀檢測 檢測兩種方法提取DNA 的濃度和純度，比較兩種實(shí)驗(yàn)方法獲得DNA 的差異。取2 μL 所得DNA，以試劑盒中緩沖溶液作為空白對照，使用Thermo NanoDrop One 超微量分光光度計檢測，讀取DNA 濃度和OD260/OD280比值，重復(fù)3 次取平均值進(jìn)行比較。計算每毫升全血對應(yīng)提取的DNA 量，即記為提取DNA 的總質(zhì)量。

1.3.3 體外PCR 擴(kuò)增 以提取得到的基因組DNA 為模板，采用TIANLONG PCR Thermal Cycler儀進(jìn)行體外PCR 擴(kuò)增，用于后續(xù)瓊脂糖凝膠電泳檢測所得DNA 質(zhì)量。

12 μL PCR 反應(yīng)體系：2× Taq 酶6 μL，ddH2O 2 μL，DNA 2 μL，引物MIX 2 μL，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。PCR 反應(yīng)條件：第一步，96 ℃變性2 min；56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增5個循環(huán)；第二步，96 ℃變性25 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增40 個循環(huán)；第三步,96 ℃變性25 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增8 個循環(huán)；第四步,25 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

表1 引物1 與引物2 對應(yīng)引物序列Tab.1 Primer sequences of primer 1 and primer 2

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測 根據(jù)是否擴(kuò)增出目的條帶，判斷兩種方法提取的DNA 是否合格。將體外擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行2% 的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)（紫外分析儀）觀察目的條帶。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS19.0 對兩種方法所提取DNA 質(zhì)量和純度均值和進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法提取DNA 時間對比結(jié)果

改良全血DNA 提取法平均耗時60 min，PBMC DNA 提取法平均耗時145 min，全血提取DNA 時間顯著少于PBMC DNA 提取法（見表2）。

表2 兩種方法提取DNA 步驟及時間Tab.2 Steps and time of DNA extracted by two methods

2.2 核酸蛋白定量儀檢測結(jié)果

用Thermo Nanodrop One 超微量紫外分光光度計測定兩種方法所提取DNA 質(zhì)量［11］，結(jié)果見表3。表3 結(jié)果顯示，改良全血DNA 提取法提取DNA 質(zhì)量（305.47 ± 151.64）ng 高于全血PBMC DNA提取法提取DNA 質(zhì)量（116.47± 181.02）ng，t= 5.062，P< 0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖1a），說明改良全血DNA 提取法獲得DNA 質(zhì)量高于全血PBMC DNA 提取法；兩種方法所提取DNAOD260/OD280值（1.77 ± 0.09）vs（1.90 ± 0.15），t= - 4.782，P> 0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1b），說明改良全血DNA 提取法提取DNA 與PBMC DNA 提取法提取DNA 純度比較無明顯差別。

表3 改良法和PBMC 法提取DNA 質(zhì)量與純度的比較Tab.3 Comparisons of the quality and purity between the improved method and PBMC to extract

圖1 兩種方法提取DNA 質(zhì)量和純度比較的散點(diǎn)圖Fig.1 A Scatter plot comparison of the quality and purity of DNA extracted by two methods

2.3 凝膠電泳檢測結(jié)果

兩種方法所提取的DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法提取的DNA 條帶光密度無明顯差異，如圖2 所示。圖2 結(jié)果提示兩種方法提取的DNA 均無損害，后期可正常投入使用。

圖2 兩種方法的凝膠電泳檢測結(jié)果比較Fig.2 Comparison of the gel electrophoresis detection results of the two methods

3 討論

從全血中提取高質(zhì)量的DNA 是進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的重要前提［11］。聚合酶鏈反應(yīng)- 序列特異性引物法（PCR- SSP）是一種常用的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法［12］，其原理是根據(jù)各個基因的核苷酸序列，設(shè)計出一套與每一等位基因都互相對應(yīng)的引物，該引物只能與某一等位基因特異性片段的堿基序列互補(bǔ)性結(jié)合，如HLA 分型、KIR 分型等大樣本檢測，這些檢測對DNA 的產(chǎn)量和純度要求較高［13］。使用PBMC DNA 提取法提取出來的DNA 純度高，是實(shí)驗(yàn)室提取DNA 的主要方法，該方法從全血中分離出PBMC 細(xì)胞，再利用DNA 提取試劑盒獲得高純度的DNA。但因分離PBMC 細(xì)胞的操作繁瑣、費(fèi)時，在實(shí)際操作中，會導(dǎo)致核酸的損失而影響PCR- SSP 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果［14］。

成熟紅細(xì)胞無核，也無任何細(xì)胞器，無法提取出DNA，而白細(xì)胞中有核，可以提取出DNA。本實(shí)驗(yàn)利用紅細(xì)胞在低滲溶液中極易裂解，而白細(xì)胞相對不易破裂這一特點(diǎn)，通過雙蒸水迅速使紅細(xì)胞裂解，而后離心取得白細(xì)胞沉淀，此法大大減少了紅細(xì)胞裂解時間，克服了從PBMC 中提取DNA 繁瑣的細(xì)胞分離步驟，能有效降低細(xì)胞損失，從而大大提高操作者的效率，在1 h 左右就可以提取出基因組DNA。由DNA 質(zhì)量進(jìn)行t檢驗(yàn)可以看出，用改良全血DNA 提取法得到的DNA 質(zhì)量顯著高于用PBMC 方法提取得到的DNA 質(zhì)量，說明改良法單位外周血DNA 得率更高，且反映純度的OD260/OD280數(shù)值均在有效范圍內(nèi)（1.8 ～2.0），無明顯的蛋白污染、DNA 降解或RNA 污染。改良全血DNA 提取法提取的DNA 用PCR 法擴(kuò)增出的目的條帶完整清晰，表明改良法未對提取的基因組DNA 造成額外損害。

綜上所述，改良全血DNA 提取法與PBMC DNA 提取法相比更簡單，效率更高，且PCR 無雜帶，證明改良全血DNA 提取法并未受到外周血中其他來源DNA 的干擾。外周血DNA 提取依然是生物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)操作之一［15］，例如移植配型、KIR 基因多樣性檢測、DNA 序列的測定等。根據(jù)對改良全血DNA 提取法提取出的DNA 的質(zhì)量和純度的分析，該方法可提高單位體積外周血DNA提取效率，還可保證其純度和DNA 不遭受多余損害。所以，本實(shí)驗(yàn)中的改良全血DNA 提取法是一種高效、經(jīng)濟(jì)的從全血中提取高質(zhì)量DNA 的方法，當(dāng)在大批量樣本檢測時比PBMC DNA 提取法更適合于PCR- SSP 的實(shí)驗(yàn)。