李志強(qiáng)，劉穎，林風(fēng)，吳麗云

(福建省微生物研究所，福建省紅曲微生物技術(shù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用工程研究中心，福建 福州，350007)

紅曲菌(Monascus)為一類(lèi)小型、腐生的絲狀真菌[1]。紅曲起源于中國(guó)，被稱(chēng)為我國(guó)的“國(guó)曲”，其可信的制作歷史已有上千年，是紅曲菌(Monascusspp.)發(fā)酵米飯制成的紫紅色曲米[2]。紅曲菌可產(chǎn)生莫納可林類(lèi)、γ-氨基丁酸、麥角固醇及食用色素等多種有益代謝產(chǎn)物[3-5]，被廣泛用作食品著色劑、魚(yú)肉防腐劑、醋酒發(fā)酵劑以及心血管病治療藥物等[5-7]，因此開(kāi)發(fā)紅曲菌具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。目前我國(guó)工業(yè)化生產(chǎn)的紅曲產(chǎn)品主要有3類(lèi)，即釀造紅曲、色曲和功能性紅曲，分別富含酯化酶或糖化酶、紅曲色素和莫納可林K[4,8]。以功能性紅曲為原料可開(kāi)發(fā)成保健品和中藥，其代表產(chǎn)品分別為天曲牌益脂康片和血脂康膠囊[9]。

自ENDO[3]發(fā)現(xiàn)紅曲菌可以產(chǎn)生具有降血脂功能的莫納可林K(monacolin K，又名洛伐他汀)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外興起紅曲產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的熱潮。然而，1977年WONG等[10]從紅曲中分離出一種抑菌因子monascidin A，該物質(zhì)在1995年被證實(shí)為一種真菌毒素——桔霉素(又叫桔青霉素，citrinin)[11]，對(duì)脊椎動(dòng)物具有肝腎毒性、致畸性和致癌性，故紅曲菌及其發(fā)酵產(chǎn)品(包括紅曲)的安全性受到了人們的質(zhì)疑。因?yàn)榻勖顾貙?duì)人體的危害性極大，我國(guó)及其他一些國(guó)家和地區(qū)對(duì)紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)品的桔霉素含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[8,12]。通過(guò)技術(shù)革新，我國(guó)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品紅曲色素中的桔霉素問(wèn)題基本得到了解決，但固態(tài)發(fā)酵紅曲米中的桔霉素超標(biāo)問(wèn)題還未解決，這既影響我國(guó)紅曲產(chǎn)品的出口，又危害消費(fèi)者的身體健康[12]。因此控制紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品中的桔霉素含量，使其符合相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)是紅曲產(chǎn)業(yè)亟需解決的課題?？梢酝ㄟ^(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件、基因工程改造或菌株選育來(lái)控制紅曲中的桔霉素含量[5]；通過(guò)傳統(tǒng)的菌株選育已篩選到不產(chǎn)桔霉素可用于生產(chǎn)功能紅曲的菌株[13-14]。

鑒于控制紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)品中桔霉素含量的需求很迫切，研究人員開(kāi)展了紅曲菌生物合成桔霉素通路的研究，試圖從分子水平上對(duì)紅曲菌株的產(chǎn)桔霉素特性進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)了一些紅曲菌的桔霉素生物合成相關(guān)基因[15-17]，并對(duì)幾種紅曲菌桔霉素生物合成相關(guān)基因的分布情況進(jìn)行了研究[18]。由于紅曲菌合成桔霉素受培養(yǎng)條件和遺傳特性的影響，且同一株紅曲菌在不同培養(yǎng)條件下的發(fā)酵產(chǎn)物中的桔霉素含量往往有很大差異[5]，因此通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中是否含有桔霉素的產(chǎn)毒紅曲菌菌株的傳統(tǒng)鑒別方法，可能不太適合產(chǎn)桔霉素紅曲菌株的鑒定，亟需有效的檢測(cè)評(píng)價(jià)方法來(lái)減少菌株篩選的工作量，進(jìn)一步確認(rèn)紅曲菌株產(chǎn)桔霉素的能力。

本研究以22株紅曲菌為研究對(duì)象，考察其基因組是否含有桔霉素生物合成相關(guān)基因，并檢測(cè)這些菌株通過(guò)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲中的桔霉素含量，以探討菌株的桔霉素生物合成相關(guān)基因與采用現(xiàn)行桔霉素檢測(cè)方法制備的紅曲中桔霉素能否檢出的相關(guān)性，也為評(píng)價(jià)紅曲菌株產(chǎn)桔霉素的能力提供基本信息。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)選擇11株紫色紅曲菌(M.purpureus)和11株紅色紅曲菌(M.ruber)。其中福建省微生物研究所紅曲菌種資源庫(kù)10株，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心4株，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心6株，美國(guó)模式培養(yǎng)物保存庫(kù)(ATCC)2株。

1.1.2 試劑

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。甲醇和乙腈(色譜純)，德國(guó)Merck公司；H3PO4(色譜純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核苷酸(dNTPs)、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)C，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，用于制備PDA斜面。種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50，蛋白胨15，酵母粉10，MgSO40.5，KH2PO41，NaNO33，用于固態(tài)發(fā)酵中紅曲菌種子液的制備。米飯培養(yǎng)基：市售大米50 g浸泡過(guò)夜，瀝干后裝入500 mL三角瓶中，用于固態(tài)發(fā)酵制備紅曲。以上培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器和設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀、2475熒光檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；XA105型電子分析天平(雙量程，d=0.01 mg/0.1 mg)，梅特勒-托利多公司；GR110DR型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，廈門(mén)致微儀器有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，Millipore公司；S1000 PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；DYY-8C穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅曲菌株的ITS復(fù)核

對(duì)選取的菌株采用ITS測(cè)序和比對(duì)的方法進(jìn)行菌種的復(fù)核，11株紅曲菌(R3、R5～R14)被鑒定為紫色紅曲菌，10株紅曲菌(R1、R2、R4、R15～R17、R19～R22)被鑒定為紅色紅曲菌，R18被鑒定為血紅紅曲菌(M.sanguineus)[19]。

1.3.2 紅曲的制備

將紅曲菌株接種至PDA斜面培養(yǎng)基活化后參照文獻(xiàn)制備種子液，將培養(yǎng)好的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%接種量轉(zhuǎn)接于米飯培養(yǎng)基后進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[14]。每個(gè)菌株固態(tài)發(fā)酵做3個(gè)平行樣本。固態(tài)發(fā)酵完成后，將紅曲米在60 ℃烘干，用料理機(jī)粉碎并過(guò)60目篩。

1.3.3 桔霉素含量的測(cè)定

參照GB 5009.222—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中桔青霉素的測(cè)定》中的免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測(cè)紅曲米中的桔霉素含量[20]。使用Waters公司的2695高效液相色譜儀及2475熒光檢測(cè)器。液相色譜條件、所制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及檢出限見(jiàn)文獻(xiàn)[19]。

1.3.4 桔霉素生物合成相關(guān)基因的擴(kuò)增及測(cè)序

菌株的液體培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[21]，培養(yǎng)完成后收集菌絲體用滅菌蒸餾水清洗。獲得純度高、完整性好的DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的前提條件，因此采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取DNA。取約200 mg清洗過(guò)的菌絲體放入滅菌的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末，再加入CTAB提取緩沖液提取DNA，用異丙醇沉淀DNA后采用蒸餾水溶解。

桔霉素聚酮合酶(citrinin polyketide synthase)基因pksCT的引物為pksCTF (5’-TGATGCGACGAAGATGTTAC-3’) 和pksCTR (5’-TCTCTATGCTGCGACTGAC-3’)[13]，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度理論上為429 bp。以紫色紅曲菌 (AB243687) 和橙色紅曲菌(M.aurantiacus，EU309474) 的桔霉素生物合成相關(guān)基因簇作為引物設(shè)計(jì)的模板，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄激活因子ctnA的引物為ctnAF (5’-AACGGACAGGAAGAGCGTGC-3’) 和ctnAR (5’-CACACCACCGATGCCATACC-3’)，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度理論上為1520 bp。PCR反應(yīng)總體積為50 μL： 10×PCR反應(yīng)緩沖液 5 μL，dNTPs(4種濃度均為2.5 mmol/L)1 μL，引物(均為10 μmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶2 U，DNA模板2 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，陽(yáng)性樣本送測(cè)序公司用凝膠回收試劑盒回收目的片段后進(jìn)行雙向測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲米中桔霉素含量的測(cè)定

表1為22株紅曲菌通過(guò)固態(tài)發(fā)酵所制紅曲米中桔霉素含量的測(cè)定結(jié)果。用11株紫色紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲中均檢出桔霉素，只有R8的桔霉素含量(18.37 μg/kg)最低，R14的含量為377.90 μg/kg，其他9份紅曲中的桔霉素含量均高于1 000 μg/kg。在10株紅色紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)的紅曲中只在4份紅曲(R4、R15、R16和R17)中檢出桔霉素，其含量為59.25～137.45 μg/kg，其他6份紅曲中未檢出桔霉素。血紅紅曲菌R18生產(chǎn)的紅曲中未檢出桔霉素。

表1 22株紅曲菌所制作的紅曲中桔霉素含量檢測(cè)及桔霉素相關(guān)基因擴(kuò)增結(jié)果Table 1 Citrinin contents of 22 samples of red yeast rice and the amplification results of citrinin biosynthesis related genes

2.2 紅曲菌桔霉素生物合成相關(guān)基因的擴(kuò)增

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用引物pksCTF和pksCTR在22株紅曲菌中的擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，其片段長(zhǎng)度符合預(yù)期。但只在紅曲米中桔霉素檢測(cè)為陽(yáng)性的紅曲菌中用ctnAF和ctnAR擴(kuò)增出單一條帶，其片段長(zhǎng)度符合預(yù)期。DNA序列分析表明本研究從10株紅色紅曲菌和11株紫色紅曲菌中擴(kuò)增的pksCT基因片段完全相同，與紫色紅曲菌AB243687的序列相似性均為100%；而血紅紅曲菌R18與紅色紅曲菌和紫色紅曲菌在擴(kuò)增的pksCT片段有11個(gè)位點(diǎn)的差異，其中包括1個(gè)位點(diǎn)的單堿基缺失(AB243687的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)為9707T)(圖1)。3次擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果均顯示血紅紅曲菌R18的pksCT基因片段在此位點(diǎn)有單堿基缺失(圖2)。

圖1 pksCT基因片段的多重排序Fig.1 Multiple sequence alignment of pksCT fragments

圖2 pksCT 基因片段的測(cè)序圖譜，顯示血紅紅曲菌R18的pksCT基因片段的單堿基缺失位點(diǎn)Fig.2 Chromatogram of the pksCT fragments. A single-base deletion was observed in the pksCT fragments of M.sanguineus R18

本研究中擴(kuò)增的pksCT基因片段位于編碼區(qū)，DNA序列的翻譯分析表明該單堿基缺失會(huì)引起蛋白質(zhì)編碼基因的移碼突變從而導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)及多個(gè)終止密碼子，這表明血紅紅曲菌R18的pksCT基因不能指導(dǎo)合成有功能的桔霉素聚酮合酶。產(chǎn)桔霉素的4株紅色紅曲菌和11株紫色紅曲菌的ctnA基因片段之間沒(méi)有序列變異，與紫色紅曲菌AB243687的序列相似性均為100%。

3 討論

紅曲菌可用于生產(chǎn)紅曲(為藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材)及食用色素，因此闡明紅曲生產(chǎn)菌株的產(chǎn)桔霉素能力是非常重要的。桔霉素、紅曲色素和莫納可林K均屬于聚酮類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，該類(lèi)物質(zhì)生物合成途徑中的關(guān)鍵酶為聚酮合酶。近年來(lái)，研究者采用分子生物學(xué)方法對(duì)紅曲菌株的桔霉素生物合成相關(guān)基因進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，通過(guò)同源重組破壞紫色紅曲菌IFO30873的pksCT基因?qū)е略摼晖耆珕适Я水a(chǎn)桔霉素的能力[15]，破壞轉(zhuǎn)錄激活因子的編碼序列ctnA則導(dǎo)致該菌株pksCT的轉(zhuǎn)錄大幅下降及發(fā)酵液中的桔霉素含量降低至幾乎檢測(cè)不出的水平[16]。我國(guó)學(xué)者通過(guò)構(gòu)建fosmid文庫(kù)對(duì)橙色紅曲菌AS3.4384的桔霉素合成相關(guān)基因簇進(jìn)行了研究，其基因序列號(hào)為EU309474[17]。經(jīng)DNA序列比較，紫色紅曲菌 (AB243687) 和橙色紅曲菌(EU309474)的桔霉素生物合成相關(guān)基因簇的DNA序列相似性為100%。據(jù)報(bào)道，利用高產(chǎn)桔霉素的野生型橙色紅曲菌AS3.4384構(gòu)建的pksCT基因缺失株P(guān)HDS26在液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵中的桔霉素產(chǎn)量均有不同程度下降，其中在酵母浸膏蔗糖培養(yǎng)基和米粉培養(yǎng)基的液態(tài)發(fā)酵及大米固態(tài)發(fā)酵中均降低了97%以上[22-23]。這些研究表明，pksCT和ctnA為紅曲菌桔霉素生物合成的關(guān)鍵基因，也為從分子水平上鑒別產(chǎn)桔霉素的紅曲菌株提供了理論基礎(chǔ)。

研究者對(duì)一些紅曲菌的桔霉素生物合成相關(guān)基因的分布情況進(jìn)行了研究。在CHEN等[18]的研究中，選用的4株M.purpureus和1株M.kaoliang(為M.purpureus的同種異名[24])均具有pksCT和ctnA基因，都可產(chǎn)生桔霉素；而6株M.ruber均缺失pksCT和ctnA基因，發(fā)酵產(chǎn)物的桔霉素檢測(cè)呈陰性；M.sanguineusATCC200613 的pksCT在擴(kuò)增的編碼區(qū)有1個(gè)位點(diǎn)的單堿基缺失(AB243687的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)為10453C，該單堿基缺失會(huì)引起移碼突變從而導(dǎo)致生成沒(méi)有功能的桔霉素聚酮合酶)，且不具有ctnA基因，發(fā)酵產(chǎn)物的桔霉素檢測(cè)為陰性。付桂明等[25]對(duì)14株產(chǎn)桔霉素的紅曲菌的pksCT基因的2個(gè)片段(包括翻譯起始區(qū)部分序列669 bp和終止密碼子區(qū)部分序列591 bp)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)14株紅曲菌的這2個(gè)DNA片段序列之間分別具有高度同源性，均與M.purpureus(AB167465)的pksCT對(duì)應(yīng)的區(qū)域序列一致。朱麗萍等[26]的研究結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增桔霉素合成相關(guān)基因?yàn)殛?yáng)性的菌株，其發(fā)酵制備的紅曲中桔霉素含量超過(guò)了QB/T 2847—2007《功能性紅曲米(粉)的桔霉素》限量標(biāo)準(zhǔn)50 μg/kg。由于ctnA編碼的轉(zhuǎn)錄激活因子正向調(diào)控紅曲菌生物合成桔霉素[16]，因此6株M.ruber所生產(chǎn)的紅曲米中未檢出桔霉素可能與這些菌株缺失ctnA有關(guān)；而M.sanguineusR18所生產(chǎn)的紅曲米中桔霉素檢測(cè)陰性可能與該菌株的pksCT無(wú)功能化有關(guān)。本研究結(jié)果也表明，所用紅曲菌菌株的桔霉素合成相關(guān)基因(pksCT和ctnA)擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性與菌株所制備的紅曲中桔霉素檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果具有高度的一致性。

CHEN等[18]只在M.purpureus和M.kaoliang中擴(kuò)增出有功能的pksCT和ctnA。本研究在產(chǎn)桔霉素的4株M.ruber和11株M.purpureus中均擴(kuò)增出有功能的pksCT和ctnA，且與M.purpureusAB243687的pksCT和ctnA的DNA序列相似性均為100%。完整的ctnA序列包含了4個(gè)短內(nèi)含子[16]，本研究中擴(kuò)增的ctnA序列包含了前3個(gè)內(nèi)含子。一般認(rèn)為內(nèi)含子的進(jìn)化速率遠(yuǎn)高于外顯子，產(chǎn)桔霉素的M.ruber和M.purpureus的ctnA和pksCT之間分別沒(méi)有序列變異表明產(chǎn)桔霉素的M.ruber和M.purpureus的桔霉素生物合成相關(guān)基因ctnA和pksCT高度保守。CHEN等[18]在其所用的M.ruber菌株中均未擴(kuò)增出pksCT和ctnA，而本研究中所有M.ruber菌株(桔霉素檢測(cè)為陰性或陽(yáng)性)均擴(kuò)增出pksCT，但只在產(chǎn)桔霉素的M.ruber菌株中擴(kuò)增出ctnA，這表明M.ruber的pksCT和ctnA基因存在與否具有多樣性。M.sanguineusATCC200613 的pksCT基因的單堿基缺失位點(diǎn)對(duì)應(yīng)AB243687的位點(diǎn)為10453C，本研究中新發(fā)現(xiàn)的M.sanguineusR18的單堿基缺失位點(diǎn)對(duì)應(yīng)AB243687的位點(diǎn)為9707T，這表明M.sanguineus的pksCT在多個(gè)位點(diǎn)有堿基缺失。由于紅曲菌合成桔霉素受培養(yǎng)條件和遺傳特性的影響[5]，且紅曲中桔霉素的檢測(cè)結(jié)果受所用檢測(cè)方法和儀器靈敏度的影響，因此桔霉素生物合成相關(guān)基因pksCT和ctnA基因的擴(kuò)增可作為篩選低產(chǎn)甚或不產(chǎn)桔霉素紅曲菌株的補(bǔ)充方法，以確認(rèn)低產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素紅曲菌株的基因特性。該方法簡(jiǎn)單、快速，可節(jié)約檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本。