劉淑君 陳苗 王鳳忠 包郁明 辛鳳姣 溫博婷

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

腸道微生物是人體生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，占人類共生微生物的90%以上［1］。腸道微生物通過多種代謝途徑利用腸道中的營養(yǎng)物質(zhì)，在人體生長發(fā)育、能量代謝、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用［2］。腸道微生物可以通過免疫、代謝等系統(tǒng)在內(nèi)的多種途徑調(diào)節(jié)大腦信號(hào)，進(jìn)而觸發(fā)微生物-腸道-腦軸的雙向應(yīng)答機(jī)制［3］。

谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（GAD，EC 4.1.15）的催化作用下可生成γ-氨基丁酸（GABA）［4］。谷氨酸和GABA是哺乳動(dòng)物體內(nèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，分別對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有興奮和抑制的作用［5-6］。GABA在人體中具有降血壓、抗氧化、抗抑郁以及調(diào)節(jié)肝腎機(jī)能等重要的生理功能，受到了人們的廣泛關(guān)注［7］。Barrett等［8］發(fā)現(xiàn)人體腸道來源的乳酸菌和雙歧桿菌在體外能夠產(chǎn)生GAD將谷氨酸鈉完全轉(zhuǎn)化生成GABA。但目前還沒有關(guān)于人體腸道微生物轉(zhuǎn)化谷氨酸的研究。

谷氨酸是組成蛋白質(zhì)或肽的結(jié)構(gòu)氨基酸之一，約占膳食蛋白的10%，是維持腸道完整性和功能的主要能量來源［9］。Janeczko等［10］發(fā)現(xiàn)在攝入谷氨酸后，血清中谷氨酸的含量有所增加。Liu等［11］通過研究肥胖人群血清中谷氨酸含量及腸道微生物的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腸道微生物的組成與血清中谷氨酸的含量存在密切聯(lián)系，且腸道微生物中谷氨酸脫羧酶基因gad的豐度與血清中谷氨酸含量呈負(fù)相關(guān)。然而，飲食攝入的谷氨酸對(duì)人體腸道微生物組成及功能的影響及其在腸道中的轉(zhuǎn)化機(jī)制尚不明確。

谷氨酸在天然食品中通常以谷氨酸鈉的形式存在，本研究以人腸道微生物為菌源、谷氨酸鈉為底物進(jìn)行體外發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中產(chǎn)氣量、pH及SCFA的變化、GAD活力及產(chǎn)物GABA含量，研究腸道微生物體外發(fā)酵對(duì)谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化能力，并進(jìn)一步通過16S微生物多樣性分析研究谷氨酸鈉的添加對(duì)腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期獲得轉(zhuǎn)化谷氨酸的特定菌群，為闡明腸道微生物轉(zhuǎn)化谷氨酸的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑：L-谷氨酸鈉，購自西格瑪奧德里齊公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、巴豆酸標(biāo)準(zhǔn)品，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；偏磷酸、磷酸氫二鉀、蛋白胨等試劑，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

糞便菌源：糞便樣本取自10名健康成人糞便（Human fecal，HF）（5名女性和5名男性，年齡22-36歲，身體健康且在試驗(yàn)前3個(gè)月內(nèi)無抗生素治療），將糞便樣品重懸于含有1.0% L-抗壞血酸的磷酸鹽緩沖液（pH 6.5，0.2 mol/L NaH2PO4和0.1 mol/L Na2HPO4）中，制備成質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10%的糞便懸浮液。

培養(yǎng)基：YCFA基礎(chǔ)培養(yǎng)基參照Schwab等［12］，實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基加入0.8% L-谷氨酸鈉為底物，空白培養(yǎng)基中不加底物。在厭氧條件下，以5 mL為單位分別加入到10 mL發(fā)酵瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，配制成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基及空白培養(yǎng)基備用。

1.2 方法

1.2.1 體外發(fā)酵 分別接種0.5 mL 10%的糞便懸浮液于添加谷氨酸鈉培養(yǎng)基（Fermentation with monosodium glutamate，F(xiàn)S）及空白培養(yǎng)基（Control，CK），37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 產(chǎn)氣及pH的測定 發(fā)酵24 h后，使用BMPTest System壓 力 表（WAL Messund Regelsysteme GmbH，奧爾登堡，德國）測量每瓶發(fā)酵液的氣壓值（kPa）；使用緊湊型pH計(jì)（型號(hào)B-212，Horiba，日本）測定發(fā)酵0 h及發(fā)酵24 h發(fā)酵液的pH值。

1.2.3 SCFAs的測定 分別取空白培養(yǎng)基和添加谷氨酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵24 h后的發(fā)酵液0.5 mL加入0.1 mL巴豆酸-偏磷酸溶液于1.5 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，充分混合均勻后，放置-20℃冰箱24 h，解凍后在14 000 r/min的條件下離心5 min，離心后取上清，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，用于SCFAs的測定。

采用GC-9720氣相色譜儀測定SCFAs含量。氣相色譜條件：色譜柱為毛細(xì)管柱HP-FFAP（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為高純氮?dú)?，流?.0 mL/min；輔助氣為氫氣和空氣；檢測器為FID氫火焰離子化檢測器，檢測溫度250℃；程序溫度：初始溫度75℃，以20℃/min升溫至180℃，平衡1 min，再以40℃/min升溫至220℃，平衡1 min；進(jìn)樣量1.0 μL；采用外標(biāo)法，測定乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸的含量。

1.2.4 GABA的測定 參考許建軍［13］的方法，利用比色法快速測定發(fā)酵液中GABA的含量。分別取空白培養(yǎng)基和添加谷氨酸鈉培養(yǎng)基發(fā)酵24 h后的發(fā)酵液100 μL，加入100 μL 6%苯酚和100 μL 5.2%次氯酸鈉，混合均勻后沸水浴加熱10 min，迅速冷卻20 min，加入200 μL 60%乙醇，室溫靜置40 min，在640 nm測定吸光值，反應(yīng)產(chǎn)物GABA的定量以標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。

1.2.5 GAD活力的測定 利用比色法快速測定谷氨酸脫羧酶的活力。100 μL經(jīng)超聲破菌后的發(fā)酵液，1 mL 0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH 4.4），1 mL 50 mmol/L L-谷氨酸鈉溶液，20 μL 10 mmol/L PLP（5’-磷酸吡哆醛），37℃ 反應(yīng)1 h。加入0.5 mL 1 mol/L碳酸鈉溶液和2.5 mL 0.2 mol/L 硼酸緩沖液（pH 9.0）終止反應(yīng)。反應(yīng)樣本中GABA含量測定同1.2.4。一個(gè)酶活力單位（IU）：每分鐘產(chǎn)生1 μmol GABA所需要的酶量。

1.2.6 16 S高通量測序分析 取3 mL谷氨酸鈉添加組體外發(fā)酵24 h的發(fā)酵液在12 000 r/min的條件下離心5 min，將獲得的沉淀和原始糞便樣本送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行總細(xì)菌DNA的提取和高通量測序分析。

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在美吉云平臺(tái)（www.majorbio.com）進(jìn)行分析。引物選用細(xì)菌16S V3-V4 區(qū)引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3'）進(jìn) 行 擴(kuò) 增。通過聚類分析，將一致性為97%的序列進(jìn)行可操作分類單元（OTU）劃分；通過繪制Shannon多樣性指數(shù)，分析微生物Alpha多樣性，反映微生物群落的豐富度和多樣性；通過主坐標(biāo)分析（PCoA），使用Bray-Curtis算法對(duì)樣本分組進(jìn)行分析；基于樣本中群落豐度數(shù)據(jù)，運(yùn)用student’st-檢驗(yàn)法檢測不同組（樣本）微生物群落中表現(xiàn)出的豐度差異的物種，對(duì)分組樣品的物種組成和群落結(jié)果進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用Graphpad 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。以組別為變量，利用t-檢驗(yàn)的方法進(jìn)行差異顯著性分析。以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中產(chǎn)氣量的變化

由圖1可知，谷氨酸鈉添加組（FS）的發(fā)酵氣壓為27.22 MPa，是空白對(duì)照組（CK）發(fā)酵氣壓8.45 MPa的3.22倍。說明以谷氨酸鈉為底物體外發(fā)酵24 h后產(chǎn)生的氣體顯著增加，腸道微生物對(duì)谷氨酸鈉具有較高的代謝能力。

圖1 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液產(chǎn)氣氣壓值

2.2 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中SCFAs產(chǎn)量的變化

腸道微生物在利用底物產(chǎn)生氣體的同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生SCFAs，SCFAs主要由乙酸、丙酸、丁酸等組成。由表1可知，在CK組和FS組體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液中，乙酸產(chǎn)量最大。與CK組相比，F(xiàn)S組中的乙酸、丙酸和丁酸的產(chǎn)量顯著增加（P＜0.01），異丁酸、戊酸和異戊酸的產(chǎn)量無顯著差異。其中，F(xiàn)S組乙酸的產(chǎn)量是CK組的4.5倍，丁酸的產(chǎn)量是CK組的26倍，丙酸的產(chǎn)量是CK組的3.42倍。且在FS組中，除乙酸外產(chǎn)量最大的為丁酸，占總酸的10.08%。

表1 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h SCFAs產(chǎn)量（N=10）

2.3 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中pH的變化

由圖2可知，本實(shí)驗(yàn)發(fā)酵前后pH介于6-7之間，基本處于中性的環(huán)境中。且在0 h和24 h時(shí)，F(xiàn)S組發(fā)酵液的pH均高于CK組。說明添加谷氨酸鈉后，會(huì)影響發(fā)酵液的pH。但與CK組相比，F(xiàn)S組發(fā)酵液pH 的變化差異不顯著。

圖2 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液的pH值

2.4 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中GABA產(chǎn)量的變化

為了研究谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化效率，測定了谷氨酸鈉體外發(fā)酵液的GABA的含量。由圖3可知，與CK組相比，在添加了谷氨酸鈉的體外發(fā)酵過程中，GABA的含量顯著增加，谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)72.36%。

圖3 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液的GABA含量

2.5 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中GAD酶活力的變化

為了研究體外發(fā)酵過程中腸道微生物轉(zhuǎn)化谷氨酸生成GABA的機(jī)制，測定了FS組體外發(fā)酵液中的GAD活力。由圖4可知，10組添加了谷氨酸鈉的發(fā)酵液中均能檢測到具有GAD活力，且不同發(fā)酵液中的GAD活力不同。其中不同個(gè)體之間酶活力的差異較大，3號(hào)樣本發(fā)酵液中檢測到的酶活力最高，為0.57 IU/mL，10號(hào)樣本發(fā)酵液中酶活力最低，為0.18 IU/mL。

圖4 谷氨酸鈉體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液中GAD的活力

2.6 谷氨酸鈉體外發(fā)酵對(duì)人體腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

通過對(duì)原始糞便組（HF）及谷氨酸鈉添加組（FS）體外發(fā)酵24 h發(fā)酵液樣本的16S微生物多樣性分析，20個(gè)樣本共獲得原始測序序列7 193 466個(gè)，經(jīng)質(zhì)控后，共獲得優(yōu)化序列948 227個(gè)。對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行OTU聚類分析，總計(jì)獲得具有97%相似性的OTU 343個(gè)。其中，HF組特有的OTU有47個(gè)，占總OTU數(shù)量的13.70%；FS組特有的OTU有14個(gè)，占總OTU數(shù)量的4.08%。

2.6.1 谷氨酸鈉體外發(fā)酵對(duì)人體腸道菌群多樣性的影響 由圖5-A可知，F(xiàn)S組的Shannon指數(shù)顯著低于HF組（P＜0.01），即添加谷氨酸鈉降低了腸道菌群的Alpha多樣性?；贐ray-Curtis距離算法，使用主坐標(biāo)分析（PCoA）分析OTU水平下兩組樣本的Beta多樣性，比較兩組樣本的組間差異性。由圖5-B可知，兩組發(fā)酵液中的微生物群落空間分離和聚類顯著（Anosim，R=0.735 1，P＜0.01），說明添加谷氨酸鈉顯著影響樣本間的群落分布。

2.6.2 谷氨酸鈉體外發(fā)酵對(duì)人體腸道菌群豐度的影響 為了探究谷氨酸鈉發(fā)酵對(duì)人體腸道菌群豐度的影響，對(duì)HF組及FS組體外發(fā)酵液樣本的物種組成成分及差異顯著性進(jìn)行分析。由圖6-A可知，在門水平上，與HF組相比，F(xiàn)S組優(yōu)勢物種的相對(duì)豐度明顯不同。在HF組中，厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobateria）為主要菌門（分別為74.3%、11.8%和11.6%）。以谷氨酸鈉為底物發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液中的厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度顯著降低（分別為36.6%和3.6%，P＜0.01），變形菌門（Proteobateria）的相對(duì)豐度升高（34.8%，P＜0.05），同時(shí)擬桿菌門（Bacteroidete）的相對(duì)豐度也顯著升高（12.7%，P＜0.001）。

圖5 谷氨酸鈉體外發(fā)酵前后群落Alpha多樣性（A）和主坐標(biāo)分析（PCoA）（B）

進(jìn)一步選取相對(duì)豐度前30的細(xì)菌，進(jìn)行屬水平相對(duì)豐度的比較（圖6-B）。由圖6-B可知，在HF組中，埃希氏菌屬（Escherichia-Shigella）、擬桿菌屬（Bacteroides）和拉克諾氏菌屬（Lachnoclostridium）的相對(duì)豐度分別為8.8%、0.8%和0.2%。以谷氨酸鈉為底物發(fā)酵24 h后，這3種菌屬的相對(duì)豐度顯著升高（分別為30.3%、9.7%和4.0%，P＜0.05），梭桿菌屬（Fusobacterium）和毛螺菌屬（Lachnospiraceae）的相對(duì)豐度也有所升高。同時(shí)，谷氨酸鈉的添加可顯著降低布勞特氏菌屬（Blautia）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和罕見小球菌屬（Subdoligranulum）的相對(duì)豐度（P＜0.05）。

2.6.3 谷氨酸鈉體外發(fā)酵中代謝通路分析 通過PICRUSt對(duì)兩組發(fā)酵液中的微生物群落進(jìn)行COG功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)兩組樣本的COG功能組成較為相似。對(duì)兩組菌群KEGG 功能（enzyme）豐度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)gad的豐度有所升高，該酶對(duì)應(yīng)的KEGG通路為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的代謝通路圖（KO00250）中的谷氨酸代謝通路（圖7）。

3 討論

飲食中的營養(yǎng)物質(zhì)可被腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs），能夠提供能量、調(diào)節(jié)炎癥、擴(kuò)張血管以及促進(jìn)腸道傷口愈合，對(duì)腸道健康有深遠(yuǎn)的影響［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸鈉體外發(fā)酵后，發(fā)酵液中的乙酸、丙酸和丁酸的含量顯著增加。其中乙酸產(chǎn)量雖最高，但丁酸的增長倍數(shù)最大，有研究結(jié)果表明谷氨酸發(fā)酵是丁酸的主要來源之一［15］，與本文的結(jié)論相一致。

產(chǎn)氣量和pH值是腸道菌群評(píng)價(jià)產(chǎn)品發(fā)酵能力的指標(biāo)［16］。發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs可以降低腸道環(huán)境pH值，提供酸性環(huán)境從而減少有害菌的生長［17-18］。然而，本研究中谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中雖產(chǎn)生了大量的SCFAs，但是發(fā)酵液pH值的變化并不明顯。谷氨酸代謝的途徑之一是在GAD的作用下，將谷氨酸脫羧生成GABA，GAD通過脫羧反應(yīng)消耗質(zhì)子來維持細(xì)菌環(huán)境的pH值［19］。同時(shí)，本研究在發(fā)酵液中檢測到GAD的活力以及產(chǎn)物GABA，說明在谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中，谷氨酸鈉在GAD的作用下脫羧產(chǎn)生了GABA。因此推測本研究中pH值不變，主要是由于谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中，發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs和谷氨酸脫羧反應(yīng)共同調(diào)節(jié)了發(fā)酵液的pH值。

16S微生物多樣性測定結(jié)果顯示谷氨酸鈉的添加降低了腸道微生物的多樣性。Wang等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在體外發(fā)酵過程中，由于營養(yǎng)物質(zhì)單一、微生物代謝產(chǎn)物不豐富，導(dǎo)致了體外發(fā)酵腸道微生物的多樣性降低。然而，盡管體外發(fā)酵具有一定的局限性，但是其仍具有一定的研究意義及可信度。且體外發(fā)酵的方法不構(gòu)成倫理約束，并允許動(dòng)態(tài)取樣研究微生物的活性。同時(shí)，Sasaki等［21］發(fā)現(xiàn)體內(nèi)研究的結(jié)果與體外發(fā)酵的結(jié)果基本一致。因此，體外發(fā)酵是研究腸道微生物功能的有效方法之一。

圖6 谷氨酸鈉體外發(fā)酵過程中腸道微生物群落組成變化門水平（A）和屬水平（B）

通過PCoA及群落組成成分及差異分析發(fā)現(xiàn)，谷氨酸鈉體外發(fā)酵對(duì)腸道菌群組成及豐度影響顯著。其中，添加谷氨酸鈉的發(fā)酵組的菌門結(jié)構(gòu)及豐度發(fā)生了顯著的改變，厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度降低，擬桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度升高。厚壁菌門主要分解纖維類物質(zhì)，擬桿菌門主要分解非纖維類碳水化合物和蛋白質(zhì)［22］，這與本研究結(jié)果一致。谷氨酸鈉體外發(fā)酵后，屬水平微生物組成也發(fā)生了顯著變化，布勞特氏菌屬（Blautia）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對(duì)豐度顯著降低，雙歧桿菌被認(rèn)為是人體有益菌，能夠促進(jìn)人體對(duì)多糖的降解及利用［23］。埃希氏菌屬、擬桿菌屬和拉克諾氏菌屬的相對(duì)豐度顯著升高。其中，GABA產(chǎn)生通路活躍表達(dá)在擬桿菌屬和埃希氏菌屬中，且擬桿菌屬能產(chǎn)生大量的GABA［24］。梭桿菌屬和毛螺菌屬的相對(duì)豐度升高，梭桿菌屬可以產(chǎn)生丁酸，而毛螺菌屬缺乏產(chǎn)生丁酸途徑，只有在產(chǎn)生丁酸的共生體時(shí)才會(huì)釋放一部分丙酮酸來產(chǎn)生丁酸［25］。丁酸是腸道菌群發(fā)酵碳水化合物后產(chǎn)生的重要短鏈脂肪酸之一，具有抗炎癥、保護(hù)腸道黏膜屏障等有益功能，并可能緩解肥胖，在細(xì)胞能量代謝和腸道穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用［26］。因此，谷氨酸鈉的體外發(fā)酵可影響腸道微生物的組成及相對(duì)豐度，并促使產(chǎn)生丁酸及GABA。

圖7 谷氨酸鈉體外發(fā)酵氨基酸代謝通路圖

Liu等［11］研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物擬桿菌屬中的多形擬桿菌作為一株谷氨酸發(fā)酵共生菌，其與血清中谷氨酸的濃度呈負(fù)相關(guān)，該菌中的gad基因的豐度與谷氨酸的濃度呈負(fù)相關(guān)。本研究中，擬桿菌屬的相對(duì)豐度顯著增加且檢測到GAD活力以及GABA。因此推測谷氨酸鈉的攝入使擬桿菌屬的相對(duì)豐度升高，同時(shí)擬桿菌屬通過分泌GAD代謝谷氨酸產(chǎn)生GABA。通過PICRUSt對(duì)發(fā)酵液微生物進(jìn)行KEGG 功能（enzyme）豐度分析，gad的豐度升高。后續(xù)可以利用宏基因組檢測，挖掘代謝谷氨酸的潛在基因，進(jìn)一步闡明谷氨酸在腸道中的代謝機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究利用體外發(fā)酵系統(tǒng)，初步探究了谷氨酸鈉發(fā)酵對(duì)腸道微生物的影響以及腸道微生物轉(zhuǎn)化谷氨酸的機(jī)制。與原始糞便樣本相比，谷氨酸鈉發(fā)酵提高了乙酸、丁酸和丙酸的產(chǎn)量，其中丁酸的產(chǎn)量增加了26倍；體外發(fā)酵后，底物谷氨酸鈉的轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.36%。同時(shí)，埃希氏菌屬和擬桿菌屬的相對(duì)豐度顯著升高，推測在腸道微生物中埃希氏菌屬和擬桿菌屬對(duì)谷氨酸的轉(zhuǎn)化具有潛在作用。

致謝

感謝浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所王欣研究員對(duì)本實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。